【摘要】：目的 了解近十年我國艾滋病三間分布特征及流行趨勢(shì)，為艾滋病防治提供線索。探討補(bǔ)體在艾滋病發(fā)病中的作用及其機(jī)制，通過靶向補(bǔ)體激活蛋白CR2-IgG1F（c以下簡(jiǎn)寫CR2-Fc）抑制HIV感染的實(shí)驗(yàn)研究，為艾滋病防控提供新思路。 方法 1.描述性分析 （1）數(shù)據(jù)來源與數(shù)據(jù)整理 2004-2013年度我國31個(gè)�。ㄖ陛犑�、自治區(qū)）艾滋病發(fā)病及死亡疫情數(shù)據(jù)（不含港、澳、臺(tái)）來源于中國疾病監(jiān)測(cè)信息報(bào)告管理系統(tǒng)；各省份人口數(shù)據(jù)來源于國家人口與健康科學(xué)數(shù)據(jù)共享平臺(tái)；1:400萬的全國�。ㄖ陛犑�、自治區(qū)）級(jí)電子地圖來源于國家地理信息研究所。將所得數(shù)據(jù)分類、篩選后導(dǎo)入Excel2010。 （2）研究方法 采用描述性流行病學(xué)分析方法對(duì)2004-2013年我國艾滋病流行現(xiàn)狀進(jìn)行分析，重點(diǎn)描述艾滋病的三間分布特征及流行趨勢(shì)。 （3）統(tǒng)計(jì)分析方法 將導(dǎo)入Excel2010的數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)發(fā)病率、死亡率和構(gòu)成比等研究指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率和構(gòu)成比的比較用χ2檢驗(yàn)。利用Excel2010、GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行圖表處理。 2.靶向補(bǔ)體激活蛋白CR2-Fc的表達(dá)、活性檢測(cè)及抑制HIV感染體外實(shí)驗(yàn) （1）補(bǔ)體激活蛋白CR2-Fc的表達(dá)與純化 將PCR擴(kuò)增得到的人CR2（SCR1-4）基因和人IgG1Fc基因進(jìn)行連接并構(gòu)建入T載體。XbaⅠ和NotⅠ雙酶切測(cè)序正確的重組T載體和pCI-neo真核表達(dá)載體，應(yīng)用T4連接酶將CR2-Fc基因連接到真核表達(dá)載體中，得到重組真核表達(dá)載體pCI-neo/CR2-Fc。重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary，CHO），G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。RT-PCR、Western blot檢測(cè)目的蛋白CR2-Fc的表達(dá)。穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行無血清培養(yǎng)，培養(yǎng)上清應(yīng)用proteinG瓊脂糖親和純化柱進(jìn)行目的蛋白的親和純化。應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gelelectrophoresis，PAGE）和BCA蛋白定量法對(duì)純化后的CR2-Fc蛋白進(jìn)行檢測(cè)。 （2）CR2-Fc蛋白生物活性鑒定與抑制HIV感染體外實(shí)驗(yàn) 綿羊紅細(xì)胞溶解實(shí)驗(yàn)判斷CR2-Fc激活補(bǔ)體的能力，即在補(bǔ)體致敏的反應(yīng)體系中加入梯度稀釋的CR2-Fc蛋白，判斷CR2-Fc的含量與補(bǔ)體活化程度之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系。應(yīng)用Anti-CR2mAb（clone1048）封閉CR2-Fc的C3d結(jié)合位點(diǎn)，觀察溶血變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CR2-Fc與細(xì)胞表面的C3d結(jié)合靶向性，使用APC標(biāo)記的Anti-C3d mAb和FITC標(biāo)記的Anti-CR2mAb兩種抗體檢測(cè)細(xì)胞表面的雙熒光信號(hào)；PBS替代CR2-Fc或EDTA阻斷C3d沉積，觀察細(xì)胞表面熒光變化。 游離HIV殺傷實(shí)驗(yàn)，即在含等量HIV-1體系中加入梯度稀釋的CR2-Fc分子活化補(bǔ)體，48h后分別感染相同數(shù)量Tzm-BL細(xì)胞。HIV感染Tzm-BL細(xì)胞后即激活熒光基團(tuán)，通過檢測(cè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度可以推斷HIV數(shù)量，間接判斷HIV殺傷率；ATP熒光法評(píng)估CR2-Fc對(duì)感染HIV細(xì)胞的影響，即通過ATP產(chǎn)生的熒光信號(hào)估計(jì)活細(xì)胞數(shù)，以此判斷CR2-Fc溶解細(xì)胞的能力。在HIV-1感染的H9細(xì)胞中加入不同濃度的CR2-Fc以及等量的正常人血清共同孵育，檢測(cè)細(xì)胞的ATP熒光值。結(jié)果 1.2004-2013年我國艾滋病流行現(xiàn)狀的描述性流行病學(xué)分析 （1）2004-2013年，我國艾滋病年均發(fā)病率為1.67/10萬，年均死亡率為0.48/10萬。近10年來，我國艾滋病發(fā)病率、死亡率均呈逐年上升趨勢(shì)（發(fā)病率變化趨勢(shì)卡方檢測(cè)Z=295.27，p0.05；死亡率變化趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)Z=154.06，p0.05）。發(fā)病率由2004年的0.28/10萬升至2013年的3.06/10萬，增幅達(dá)992.86%；死亡率由2004年的0.06/10萬升至2013年的0.83/10萬，增幅為1283.33%。 （2）2004-2013年，全國31個(gè)�。ㄖ陛犑�、自治區(qū)）均有艾滋病病例報(bào)告，，發(fā)病率高于1/10萬的省份由2004年的1個(gè)上升到了2013年的21個(gè)。我國艾滋病疫情呈現(xiàn)流行范圍廣和地區(qū)差異大的特點(diǎn)。艾滋病高發(fā)區(qū)主要集中在我國西南部，廣西省艾滋病年均發(fā)病率為6.51/10萬居全國首位，其它發(fā)病率較高的省份依次是云南、新疆、河南，發(fā)病率分別為5.29/10萬、3.89/10萬、2.10/10萬。年均發(fā)病率較低的3個(gè)省份依次為：山東省0.12/10萬，內(nèi)蒙古0.13/10萬和西藏0.16/10萬。 （3）2004-2013年我國艾滋病發(fā)病人群男性明顯多于女性，男性病例占到總病例數(shù)的70.48%，男女病例性別比為3.88:1。近10年男女病例性別比呈逐年增高趨勢(shì)（趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)Z=32.17，p0.05），比值由2004年的1.92:1上升至2013年的2.97:1。從年齡分布來看，艾滋病發(fā)病以青壯年為主，20-59歲病例占到總病例的86.35%。其中30-39歲年齡組為艾滋病高發(fā)年齡組，病例數(shù)占總報(bào)告病例的32.38%，其次是40-49歲年齡組的21.67%和20-29歲年齡組的20.57%。0-9歲年齡組病例最少，僅占全部病例的1.12%。 2.靶向補(bǔ)體激活蛋白CR2-Fc的表達(dá)、活性鑒定及抑制HIV感染體外實(shí)驗(yàn) （1）重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建、CR2-Fc蛋白的表達(dá)與純化 利用PCR成功合成了人CR2(SCR1-4)基因和人IgG1Fc基因，1%瓊脂糖凝膠電泳可見CR2-Fc基因條帶位于1,800bp處；雙酶切重組真核表達(dá)載體，電泳可見5,800bp和1,800bp兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致；CR2-Fc基因的測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列一致，證實(shí)目的基因準(zhǔn)確無誤。RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA：1%瓊脂糖凝膠電泳顯示目的條帶約1800bp，與預(yù)期一致，證明細(xì)胞內(nèi)存在CR2-Fc的轉(zhuǎn)錄。使用Anti-CR2mAb（clone1048）以及Anti-IgG1Fc mAb分別作為檢測(cè)抗體對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示：還原態(tài)樣本位于60kDa處，與預(yù)期結(jié)果一致；非還原態(tài)樣本位于130kDa處，提示自然條件下CR2-Fc以二聚體的形式存在�？蛰d體轉(zhuǎn)染上清作對(duì)照未見條帶；純化樣本進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示：還原態(tài)樣本位于60kDa處，非還原態(tài)樣本約為130kDa，結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。Quantity One軟件分析SDS-PAGE結(jié)果，樣本蛋白純度大于90%。BCA法蛋白定量得到CR2-Fc蛋白濃度約為900μg/ml。 （2）CR2-Fc生物活性鑒定及抑制HIV感染體外實(shí)驗(yàn) 蛋白活性鑒定：溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示隨著CR2-Fc濃度增加，紅細(xì)胞溶解率顯著提高（趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)Z=2.12，p0.05）。添加過量的Anti-CR2mAb（clone1048，250μg/ml），溶血率未發(fā)生明顯變化，表明Anti-CR2mAb能競(jìng)爭(zhēng)性抑制CR2-Fc與C3d的結(jié)合作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：正常激活補(bǔ)體并加入CR2-Fc分子，能夠在細(xì)胞表面檢測(cè)到APC及FITC雙熒光信號(hào)；正常激活補(bǔ)體并用PBS取代CR2-Fc分子，只能在細(xì)胞表面檢測(cè)到APC熒光信號(hào)；42mM EDTA阻斷補(bǔ)體激活，則無APC和FITC熒光信號(hào)檢出。 抑制HIV感染體外實(shí)驗(yàn)：利用Tzm-BL細(xì)胞熒光法檢測(cè)CR2-Fc對(duì)游離HIV殺傷能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)蜐舛戎泻涂贵w存在時(shí)，融合蛋白CR2-Fc能夠靶向結(jié)合于HIV-1表面的C3d分子，通過級(jí)聯(lián)放大激活補(bǔ)體，提高補(bǔ)體溶解HIV的作用。隨著CR2-Fc分子濃度增加，HIV-1殺傷率增加，當(dāng)CR2-Fc濃度為10.31μM達(dá)到峰值，HIV-1的殺傷率為34.26±6.43%。用C6缺陷血清取代NHS后，熒光信號(hào)未見明顯變化；ATP熒光法結(jié)果提示，補(bǔ)體對(duì)H9細(xì)胞表面HIV殺傷能夠引起細(xì)胞溶解。隨著CR2-Fc濃度增加，溶解受感染細(xì)胞能力增強(qiáng)，細(xì)胞溶解率由-2.10±3.52%（CR2-Fc濃度0.01μM）上升至18.49±4.28%（CR2-Fc濃度10.31μM）。用C6缺陷血清替代正常人血清，熒光檢測(cè)結(jié)果未見明顯變化。 結(jié)論 近十年我國艾滋病疫情發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年升高趨勢(shì)，艾滋病發(fā)病具有疫情分布廣、地區(qū)差異大的特點(diǎn)，因此目前我國艾滋病疫情依然嚴(yán)峻，防控形勢(shì)不容樂觀；為進(jìn)一步提高艾滋病的防治能力，本研究針對(duì)補(bǔ)體在艾滋病感染機(jī)制中的作用和特點(diǎn)，構(gòu)建并表達(dá)了一種新型靶向局部補(bǔ)體激活蛋白CR2-Fc。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CR2-Fc具有很好的生物學(xué)活性及抑制HIV-1感染能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.91

【參考文獻(xiàn)】

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1 張劍,魏強(qiáng);補(bǔ)體C3在艾滋病發(fā)病機(jī)制中的輔助作用[J];國外醫(yī)學(xué)(皮膚性病學(xué)分冊(cè));2004年01期

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本文編號(hào)：2443856