發(fā)布時(shí)間：2019-02-17 19:37

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)分為HIV-1與HIV-2。絕大多數(shù)HIV感染是由HIV-1造成的,并且90%以上的HIV-1感染者會(huì)在10-12年內(nèi)發(fā)展成為艾滋病。HIV-1極易在感染過程中發(fā)生突變,逃逸人體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控,通過疫苗誘導(dǎo)HIV-1廣譜中和抗體的產(chǎn)生是很困難的,因此設(shè)計(jì)保護(hù)性HIV-1疫苗一直是人類的夢(mèng)想。盡管抗病毒藥物在治療HIV-1方面取得了顯著的成果,但目前還沒有疫苗能有效地預(yù)防和控制HIV-1感染。HIV-1自然感染過程中,會(huì)產(chǎn)生廣譜中和抗體,近年來分離的VRC01類抗體、PT系列和PGT系列抗體能中和目前世界范圍內(nèi)流行的大多數(shù)毒株,尤其是VRC01類抗體能中和90%以上的世界流行株。但HIV-1廣譜中和抗體,在HIV-1感染后數(shù)月甚至1-2年后才會(huì)產(chǎn)生。HIV-1自然感染過中,廣譜中和抗體產(chǎn)生相對(duì)比較滯后,因此不能有效地清除體內(nèi)感染的HIV-1病毒。最近,人們通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法,研究HIV-1廣譜中和抗體與HIV-1膜蛋白gp120或者gp41復(fù)合物的結(jié)構(gòu),對(duì)HIV-1廣譜中和抗體以及這些抗體所識(shí)別的HIV-1膜蛋白的保守性表位有了更加深入的了解。了解HIV-1廣譜中和抗體以及這些抗體所識(shí)別的抗原表位,有助于HIV-1疫苗的研究。我們可以根據(jù)HIV-1廣譜中和抗體的表位進(jìn)行HIV-1疫苗的免疫原設(shè)計(jì),同時(shí)也可以將HIV-1廣譜中和抗體用于被動(dòng)免疫。 本文選取HIV-1廣譜中和抗體PGT135進(jìn)行研究,對(duì)已有的PGT135抗體基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,在293T細(xì)胞中進(jìn)行抗體的大量表達(dá)和純化,對(duì)PGT135進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)解析；檢測(cè)PGT135抗體對(duì)HIV-1假病毒中國(guó)流行株的中和敏感性；用酵母展示隨機(jī)抗原片段庫,篩選PGT135抗體所識(shí)別的抗原表位；用酵母展示抗原隨機(jī)突變庫,篩選PGT135抗體所識(shí)別的抗原表位的重要氨基酸位點(diǎn),用假病毒中和抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PGT135抗體所識(shí)別抗原表位中的關(guān)鍵性位點(diǎn)；表達(dá)PGT135抗體所識(shí)別的抗原表位片段,通過篩選人類非免疫的單鏈抗體(single chain fragments variablescFvs)酵母庫,尋找與PGT135抗體類似的HIV-1廣譜中和抗體。 通過解析PGT135抗體的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)PGT135抗體比VRC01類抗體的重鏈有較長(zhǎng)的互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region, CDRH3),可能對(duì)這類抗體識(shí)別隱蔽的糖基化位點(diǎn)有一定的幫助；PGT135抗體對(duì)HIV-1中國(guó)流行株病毒大多數(shù)有中和抑制作用；用酵母展示抗原隨機(jī)突變庫,篩選出PGT135抗體的抗原表位在HIV-1膜蛋白gp120的V3loop區(qū)和V4loop區(qū)之間；利用酵母表面展示抗原隨機(jī)突變庫,篩選出PGT135抗體所識(shí)別的重要氨基酸位點(diǎn)。用假病毒中和抑制實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證了HIV-1膜蛋白上僅僅一個(gè)糖基化位點(diǎn)的改變,就可以改變抗體對(duì)HIV-1的中和敏感性。用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的PGT135識(shí)別的抗原表位,從人類未免疫的scFvs,篩選出對(duì)PGT135抗體表位的抗原片段有結(jié)合能力的抗體。 對(duì)HIV-1廣譜中和抗體PGT135晶體結(jié)構(gòu)的解析以及它所識(shí)別的抗原表位研究,可以為HIV-1疫苗的設(shè)計(jì)提供幫助�？梢詫GT135抗體所識(shí)別的表位用于設(shè)計(jì)HIV-1疫苗的免疫原,也可以將PGT135用于被動(dòng)免疫中疫苗的設(shè)計(jì)。
[Abstract]:Human Immunodeficiency Virus (HIV) is divided into HIV-1 and HIV-2. Most of the HIV infections are caused by HIV-1, and more than 90% of HIV-1 infections will develop into AIDS within 10-12 years. HIV-1 is very easy to mutate in the course of infection, to escape the monitoring of the immune system of the human body, and to induce the production of the HIV-1 broad-spectrum neutralizing antibody by the vaccine is very difficult, so the design of the protective HIV-1 vaccine has been a human dream. Although antiviral drugs have achieved significant results in the treatment of HIV-1, no vaccine is currently available to effectively prevent and control HIV-1 infection. In the course of HIV-1 natural infection, a broad-spectrum neutralizing antibody is generated, and in recent years, the isolated VRC01 antibody, the PT-series and the PGT-series antibody can be used for neutralizing more than 90% of the world-wide strains in the current world. However, the HIV-1 broad-spectrum neutralizing antibody can only be produced in the months after HIV-1 infection and even after 1-2 years. The HIV-1 naturally-infected, broad-spectrum neutralizing antibody is relatively late, so it is not possible to effectively remove the in-vivo infected HIV-1 virus. Recently, by means of structural biology, the structure of HIV-1 broad-spectrum neutralizing antibody and HIV-1 membrane protein gp120 or gp41 complex is studied, and the conservative table position of HIV-1 membrane protein identified by the anti-HIV-1 broad-spectrum neutralizing antibody and these antibodies has been better understood. To understand the HIV-1 broad spectrum neutralizing antibodies, and the epitope identified by these antibodies, contribute to the study of the HIV-1 vaccine. The HIV-1 vaccine's immunogen design can be carried out according to the HIV-1 broad spectrum and the epitope of the antibody, and the HIV-1 broad spectrum neutralizing antibody can also be used for passive immunization. In this paper, an HIV-1 broad-spectrum neutralizing antibody, PGT135, is selected to be used for codon optimization of the existing PGT135 antibody gene. The expression and purification of the antibody in the 293T cell are carried out, and the crystal structure of the PGT135 is analyzed; and the neutralization sensitivity of the PGT135 antibody to the HIV-1 pseudovirus Chinese epidemic strain is detected. sex; using a yeast to display a random antigen fragment library to screen the epitope of the antigen identified by the PGT135 antibody; displaying an antigen random mutation library with a yeast, screening an important amino acid position of the epitope of the antigen identified by the PGT135 antibody, The key site in the epitope of the antigen identified by the PGT135 antibody was verified by the false virus neutralization inhibition assay; the epitope fragment of the antigen identified by the PGT135 antibody was expressed, and the HIV-1 broad-spectrum neutralizing anti-HIV-1 similar to the PGT135 antibody was found by screening the yeast library of the human non-immune single chain antibody. By analyzing the crystal structure of the PGT135 antibody, it is found that the PGT135 antibody has a longer complementary determining region (CDRH3) than the heavy chain of the VRC01 antibody, and it is possible to identify the hidden glycosylation site for the antibody. The PGT135 antibody has a neutralizing effect on most of the HIV-1 Chinese epidemic strains, and the yeast shows the antigen random mutation library, and the antigen table of the PGT135 antibody is screened between the V3loop region and the V4loop region of the HIV-1 membrane protein gp120, and the antigen is displayed on the surface of the yeast. Mutant library for screening important amino groups identified by the PGT135 antibody Acid sites. The alteration of only one glycosylation site on the HIV-1 membrane protein can be altered by neutralizing the inhibition assay with a pseudovirus, and the neutralization of the antibody against HIV-1 can be altered Sensitivity. The epitope of the antigen identified by the PGT135 expressed by the insect cells, the ability to bind to the antigen fragment of the epitope of the PGT135 antibody from the human unimmunized scFvs. The analysis of the crystal structure of the HIV-1 broad spectrum and the antibody PGT135, as well as the epitope of the antigen identified by it, can be the design of the HIV-1 vaccine The meter provides help. The table bits identified by the PGT135 antibody can be used to design the immunogen for the HIV-1 vaccine or the PGT135 can be used in passive immunization
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.91

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本文編號(hào)：2425525