【摘要】：目的 艾滋病癡呆綜合征(ADC)是艾滋病中最常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,一般晚期HIV感染者易患此病,是由人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)造成病人意識(shí)、行為和運(yùn)動(dòng)功能改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的綜合征。迄今為止,ADC的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但有多項(xiàng)研究證明HIV不能直接感染神經(jīng)元,而是通過感染腦組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,引發(fā)炎癥反應(yīng)釋放細(xì)胞因子及自由基,最終損傷大腦神經(jīng)元。HIV感染可使人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子-α(TNF-a)和白細(xì)胞介素(IL)等多種具有潛在神經(jīng)毒性作用的細(xì)胞因子,其中TNF-α、IL-1β是ADC發(fā)病過程中最重要的兩種,它們能提高血腦屏障的通透性以利于HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞侵入大腦,增強(qiáng)病毒復(fù)制,還能與趨化因子共同作用擴(kuò)大炎癥反應(yīng),損害神經(jīng)元。 HIV-1的早期基因負(fù)調(diào)控因子(Nef)是HIV-1調(diào)節(jié)蛋白之一,能夠下調(diào)病毒轉(zhuǎn)錄,延長病毒壽命,增強(qiáng)病毒的復(fù)制能力和感染性,并干擾生長因子介導(dǎo)的與增殖、分化和凋亡有關(guān)的信號(hào)通路,促進(jìn)艾滋病病情的進(jìn)展。 HIV-1為逆轉(zhuǎn)錄病毒,具有高度的變異性,而HIV-1基因的變異很有可能與ADC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。為了探討ADC患者體內(nèi)]HIV-1nef基因的變異,以及這種變異所引起的氨基酸位點(diǎn)改變及其與ADC之間的關(guān)系等,本論文對(duì)一例ADC病人的CNS和外周共5個(gè)部位來源的25株HIV-1nef全序列進(jìn)行了基因多樣性分析,并研究了nef基因變異導(dǎo)致的氨基酸位點(diǎn)的改變以及對(duì)U87細(xì)胞分泌TNF-α,IL-1β的影響,為探討ADC的發(fā)病機(jī)制提供思路。 方法 1.提取1例ADC病例尸檢標(biāo)本的CNS(基底核、額葉灰質(zhì)、腦膜、顳葉)和外周(脾)的共5個(gè)部位組織中的基因組DNA并以其為模板,PCR擴(kuò)增HIV-1nef基因全序列,PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)氨芐青霉素及藍(lán)白班篩選挑取陽性菌落增菌后測(cè)序,序列經(jīng)BLAST分析后,每個(gè)部位取5個(gè)HIV-1nef序列,利用Bioedit、MEGA4等生物學(xué)軟件進(jìn)行基因距離、系統(tǒng)進(jìn)化樹、同義／非同義替換值(ds/dn)以及氨基酸位點(diǎn)變異等分析。 2.根據(jù)序列分析結(jié)果選取CNS和外周來源的基因變異較大的HIV-1nef陽性克隆各一株(共5株),將這5株陽性克隆以及本室保存的pcDNA3.1穿梭載體增菌后凝膠回收,并進(jìn)行雙酶切,回收鑒定后以T4連接酶將經(jīng)過雙酶切的nef和pcDNA3.1連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,經(jīng)氨芐青霉素及藍(lán)白斑篩選出重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體,用雙酶切鑒定證實(shí)。然后將重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中,培養(yǎng)22～62h后經(jīng)免疫組化法及western-blot檢測(cè)Nef表達(dá)情況,并收集上清,ELISA法測(cè)定U87細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β的含量,SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果 1.成功克隆了一例ADC病人CNS和外周共5個(gè)部位來源的25株]HIV-1nef基因,經(jīng)測(cè)序BLAST分析證實(shí)均為HIV-1nef基因序列,并證明了該ADC患者感染的是HIV-1B亞型。與標(biāo)準(zhǔn)序列HXB2比較,通過系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),CNS和外周的nef基因序列位于進(jìn)化樹中不同的進(jìn)化枝上,表明該ADC患者體nef基因序列在CNS和外周中存在的核苷酸變異不同,而CNS不同部位的nef基因序列大多位于不同的進(jìn)化枝上,且個(gè)別序列之間存在交叉現(xiàn)象,表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中不同部位的nef基因所存在的變異也不盡相同,由此說明HIV-1nef存在基因多樣性,且可能在進(jìn)化的過程中受到區(qū)室化作用影響,并存在遷移現(xiàn)象。而由組間基因距離分析可以看出,相同組織來源的nef序列基因距離較小,而CNS和外周的nef基因距離差異較大,可見不同的機(jī)體環(huán)境對(duì)基因變異也具有一定選擇作用。 2.通過對(duì)ds/dn值的研究發(fā)現(xiàn),該ADC病例所有HIV-1nef基因序列的ds/dn=2.3241±1.7529,外周組織的HIV-1nef基因序列的ds/dn=3.1809±1.1119,CNS的HIV-1nef基因序列的ds/dn=1.7924±1.2213, ds/dn均大于1(P0.05)。表明CNS和外周的HIV-1nef基因變異均受到負(fù)向選擇壓力,病毒自身變異起主要作用,同時(shí)機(jī)體傾向于清除有害的非同義突變。 3.氨基酸位點(diǎn)分析結(jié)果顯示,該ADC病例CNS和外周的Nef氨基酸變異位點(diǎn)及頻率均不同,有些氨基酸位點(diǎn)變異在CNS和外周都有發(fā)生,有些位點(diǎn)變異只發(fā)生在CNS,有些位點(diǎn)變異只發(fā)生在外周。 4.成功構(gòu)建HIV-1nef基因的重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中,培養(yǎng)36～48h后免疫組化法檢測(cè)Nef蛋白表達(dá)情況,于細(xì)胞內(nèi)均可見到棕色顆粒沉淀,western-blot亦可檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá),說明重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功,并在U87細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。 5.ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子含量,結(jié)果顯示,未轉(zhuǎn)染重組pcDNA3.1-nef真核表達(dá)載體的U87細(xì)胞上清的空白對(duì)照組與僅加入轉(zhuǎn)染試劑及僅加入pcDNA3.1質(zhì)粒的對(duì)照組相比,TNF-α、IL-1β的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明轉(zhuǎn)染試劑及pcDNA3.1質(zhì)粒均對(duì)U87細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β水平?jīng)]有影響；與空白對(duì)照組相比,Nef蛋白實(shí)驗(yàn)組U87細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β的含量均有顯著升高(P0.05),說明Nef蛋白能誘導(dǎo)并增強(qiáng)U87細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β,但CNS來源與外周組織來源的Nef蛋白對(duì)U87細(xì)胞TNF-α及IL-1p的分泌量的影響沒有明顯的差異(P0.05)。 結(jié)論 1.ADC患者不同組織部位nef基因變異不同,其變異同時(shí)受到自身變異和環(huán)境選擇雙重作用,其中病毒自身變異起主要作用,同時(shí)機(jī)體傾向于清除有害的非同義突變。 2.不同組織部位Nef氨基酸變異不同,對(duì)Nef蛋白產(chǎn)生的影響亦不相同,可能導(dǎo)致Nef蛋白某些功能的改變,影響HIV-1在ADC患者體內(nèi)的復(fù)制、感染、凋亡等,可能與ADC發(fā)病機(jī)制有一定聯(lián)系,需進(jìn)一步研究。 3. HIV Nef蛋白能誘導(dǎo)并增強(qiáng)人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞U87分泌TNF-α、IL-1β的能力。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.91

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2416445