【摘要】：目的研究micro RNA-638通過調(diào)節(jié)MAPK14的表達(dá),參與BCG引起的炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。方法1.通過mi Randa、Targetscan和Pic Tar等靶基因預(yù)測軟件對micro RNA-638(mi R-638)可能的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示,與固有免疫應(yīng)答關(guān)系密切的MAPK14是理想的研究靶基因,本課題擬將MAPK14的3'UTR構(gòu)建到p MIR-Report表達(dá)載體中,同時(shí)應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將過表達(dá)mi R-638及抑制mi R-638表達(dá)的質(zhì)粒分別與p MIR-Report-MAPK14重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),以海腎熒光素酶作為參照,進(jìn)行熒光素酶檢測,以此驗(yàn)證mi R-638與MAPK14之間的靶向作用關(guān)系。2.根據(jù)最新mi RBase數(shù)據(jù)庫人源mi R-638(mi RBase NO:MI0003653)的基因序列,化學(xué)合成含有mi R-638成熟序列的短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,sh RNA),并構(gòu)建入穿梭載體p Sico R質(zhì)粒中,經(jīng)雙酶切及測序鑒定,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒與p CMV-VSV-G、p CMV-d R8.91兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,包裝過表達(dá)mi R-638的慢病毒,并測定病毒滴度;另外合成mi R-638 inhibitors(23 nt 2’-甲氧修飾的RNA寡核酸,能有效抑制成熟mi R-638的表達(dá))。3.將包裝成功的LV-mi R-638慢病毒及mi R-638 inhibitors分別侵染THP-1細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的巨噬細(xì)胞,24h后再應(yīng)用BCG刺激細(xì)胞12h,收集細(xì)胞及細(xì)胞上清液,提取micro RNAs、m RNA和全蛋白,應(yīng)用Real-Time PCR檢測mi R-638表達(dá)水平及MAPK14的m RNA的表達(dá)水平,應(yīng)用Western Blot檢測MAPK14蛋白的表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA檢測細(xì)胞上清液的細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-12的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1.通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測,最終我們選定了在p38MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用的MAPK14作為研究的靶基因。通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)證實(shí)了mi R-638可以靶向結(jié)合MAPK14 3’UTR的作用位點(diǎn)并抑制其表達(dá);轉(zhuǎn)染了p Sico R-mi R-638過表達(dá)載體組,MAPK14的相對熒光素酶活性與突變體的活性相比下降約5.5倍(P0.05),與正常對照組相比下降約6.1倍(P0.05);而轉(zhuǎn)染了mi R-638 inhibitor組,MAPK14的熒光素酶活性與突變體的活性相比有所升高,與p Sico R-mi R-638過表達(dá)載體組相比升高約6.6倍(P0.05)。2.成功構(gòu)建了p Sico R-mi R-638慢病毒表達(dá)載體,并成功包裝慢病毒以及病毒滴度的測定,測定結(jié)果顯示病毒滴度達(dá)1x106TU/m L3.mi R-638表達(dá)量的檢測結(jié)果證實(shí),轉(zhuǎn)染重組載體p Sico R-mi R-638后mi R-638表達(dá)上調(diào)31.2倍(p0.05),轉(zhuǎn)染mi R-638 inhibitors后mi R-638表達(dá)量與正常對照組相比下調(diào)20.2倍(p0.05)。結(jié)果表明p Sico R-mi R-638重組慢病毒可以在巨噬細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)成熟的mi R-638,從而顯著上調(diào)mi R-638的表達(dá)水平;mi R-638 inhibitors可以抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)mi R-638的表達(dá)。MAPK14 m RNA Real-Time PCR結(jié)果顯示:過表達(dá)mi R-638后MAPK14 m RNA的表達(dá)水平較正常對照組相比下調(diào)50.1倍(p0.05);抑制mi R-638表達(dá)后MAPK14 m RNA的表達(dá)水平較正常對照組相比有所上調(diào)。Western blot分析結(jié)果顯示:p Sico R-mi R-638重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,MAPK14蛋白表達(dá)量較正常組明顯降低,抑制mi R-638表達(dá)后MAPK14蛋白質(zhì)表達(dá)量增加,而BCG刺激三組細(xì)胞后MAPK14的蛋白表達(dá)量都有所增加。通過ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-12的表達(dá),來觀察mi R-638對MAPK14的下游細(xì)胞因子的影響,評價(jià)mi R-638對p38MAPK信號通路炎性反應(yīng)的調(diào)控。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染p Sico R/mi R-638后巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表達(dá)顯著性降低,而轉(zhuǎn)染mi R-638 inhibitors后巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-12的蛋白表達(dá)顯著性升高。這些結(jié)果表明mi R-638可以通過靶向作用MAPK14的表達(dá),影響下游細(xì)胞因子的表達(dá),在p38MAPK信號通路中起到負(fù)向調(diào)控作用。結(jié)論1.成功包裝了高滴度的、可過表達(dá)mi R-638的慢病毒顆粒,并證實(shí)mi R-638可以通過作用于MAPK14的3'UTR來抑制其表達(dá)。2.mi R-638可以通過靶向調(diào)控MAPK14的表達(dá),直接影響p38/MAPK通路下游細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的表達(dá),介導(dǎo)其炎性反應(yīng),負(fù)向調(diào)控BCG與巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)。MAPK14作為p38MAPK信號傳導(dǎo)通路的一個(gè)關(guān)鍵分子,是多種炎癥反應(yīng)信號通路向下游傳導(dǎo)的核心環(huán)節(jié),在病原微生物感染機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)過程中具有重要作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R52

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本文編號：2349859