發(fā)布時(shí)間：2018-11-11 20:27

【摘要】：結(jié)核病,是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起并經(jīng)呼吸道傳播的一種慢性傳染病,嚴(yán)重的危害人類(lèi)健康。病原菌主要侵入人體的肺部,以肺結(jié)核病(pulmonary tuberculosis,PTB)最為常見(jiàn)。近年來(lái),由于人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)流行、藥物的濫用導(dǎo)致MTB耐藥的出現(xiàn),再加上人們對(duì)結(jié)核菌并沒(méi)有引起足夠重視,使得世界范圍內(nèi)的結(jié)核病又死灰復(fù)燃。盡管全球通過(guò)擴(kuò)展直接觀察與短程治療戰(zhàn)略及投入大量的資金來(lái)提高結(jié)核病治療的完成率,但低下的疾病病例檢出率仍然是結(jié)核病控制的主要障礙,導(dǎo)致結(jié)核病成為發(fā)病率和死亡率最高的感染性疾病之一。提高病人的檢出率并及時(shí)治療病人是有效控制結(jié)核病傳染源,遏制結(jié)核病流行的最重要措施。目前臨床上結(jié)核病的診斷方法有多種,都由于各種原因都無(wú)法滿足臨床上輔助診斷與指導(dǎo)用藥的需要,因此,迫切需要發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)病人和結(jié)核病的有效防控。血清中的蛋白具有非常重要的生理功能,主要包括參與人類(lèi)機(jī)體的代謝、免疫、運(yùn)輸、物質(zhì)交換、信號(hào)調(diào)節(jié)、凝血作用。在病理狀態(tài)下血清中低豐度蛋白質(zhì)的組成和數(shù)量通常會(huì)發(fā)生變化,因此這些具有重要生物學(xué)功能的表達(dá)量很低的蛋白質(zhì)對(duì)于疾病的監(jiān)測(cè)和診斷有著重要的意義。為了發(fā)現(xiàn)結(jié)核病的血液標(biāo)志物,首先需要確定結(jié)核病人特別是肺結(jié)核病病人是否存在血液標(biāo)志物,因此,本研究第一部分針對(duì)近年來(lái)結(jié)核的易感標(biāo)志物研究進(jìn)行系統(tǒng)的文獻(xiàn)分析。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核的遺傳易感性是由多基因所決定的,其中有關(guān)人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)等位基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的相關(guān)性備受關(guān)注。因此,通過(guò)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)的分析從基因水平上確認(rèn)在血液中可以找到與結(jié)核病相關(guān)的易感性標(biāo)志物。基因是遺傳信息的攜帶者,而生命活動(dòng)的執(zhí)行者卻是蛋白質(zhì),與易感性基因標(biāo)志物相比,蛋白質(zhì)標(biāo)志物可能與結(jié)核病的相關(guān)性更大。相對(duì)和絕對(duì)定量的同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)標(biāo)記的基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)作為新學(xué)科及蛋白組學(xué)研究技術(shù)平臺(tái),為發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病的血清標(biāo)志物提供了新思路,蛋白質(zhì)組學(xué)及其相關(guān)技術(shù)讓人類(lèi)能夠熟知細(xì)胞和生命有機(jī)體在特定時(shí)間和空間內(nèi)所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。因此,本研究的第二和第三部分利用相對(duì)定量的蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證血清蛋白性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin,SHBG)、微管蛋白α-3E鏈(Tubulin alpha-3E chain,TBA3E)分別作為肺結(jié)核病和耐多藥肺結(jié)核病的有價(jià)值的候選標(biāo)志物。第一部分結(jié)核病易感標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)性分析目的:采用Meta分析的方法對(duì)國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的有關(guān)于HLADRB1、HLA-DQ基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的文獻(xiàn)進(jìn)行綜合分析,尋找結(jié)核病相關(guān)的易感基因。方法:在Pub Med和EMBASE中,應(yīng)用關(guān)鍵詞‘‘Mycobacterium tuberculosis’’、‘‘tuberculosis’’、‘‘MTB”或‘‘TB”、‘‘HLA-DRB1’’、‘‘HLADQA1’’或‘‘HLA-DQB1’’或‘‘human leukocyte antigen’’或‘‘HLA antigen’’、‘‘Polymorphism”、‘‘Polymorphisms”、或‘‘Genetic polymorphism”搜索1980年1月到2014年6月期間發(fā)表的相關(guān)英文文獻(xiàn)。應(yīng)用Stata版本11.2軟件包對(duì)納入的研究結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果:最終分別有21篇和12篇關(guān)于HLA-DRB1基因和HLA-DQ基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系的文獻(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)并納入研究。研究結(jié)果表明HLA-DRB1*15、DRB1*08:03和DQB1*0601等位基因多態(tài)性增加結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)(DRB1*15:OR=1.49,95%CI:1.13-1.97,P=0.005;DRB1*08:03:OR=1.90,95%CI:1.25-2.90,P=0.003),而HLA-DRB1*03、HLA-DRB1*11、DRB1*11:03和DRB1*12:02等位基因多態(tài)性降低結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)(DRB1*03:OR=0.82,95%CI:0.68-0.99,P=0.049;DRB1*11:OR=0.71,95%CI:0.54-0.93,P=0.013;DRB1*11:03:OR=0.3,95%CI:0.1-0.4,P=0.028;DRB1*12:02::OR=0.62,95%CI:0.39-0.98,P=0.043)。亞組分析結(jié)果表明DRB1*03和DRB1*07:01等位基因多態(tài)性會(huì)降低亞洲人群結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(DRB1*15:OR=0.78,95%CI:0.62-0.99,P=0.037;DRB1*07:01:OR=0.71,95%CI:0.53-0.95,P=0.020),而DRB1*15、DRB1*08:03和DQB1*0601等位基因多態(tài)性增加亞組人群結(jié)核病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(DRB1*15:OR=1.80,95%CI:1.48-2.20,P=0.000;DRB1*08:03:OR=1.91,95%CI:1.25-2.92,P=0.003)。HLA-DQA1等位基因多態(tài)性與結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)。結(jié)論:HLA-DRB1和HLA-DQB1等位基因多態(tài)性與結(jié)核病強(qiáng)相關(guān),可能是其易感標(biāo)志物。HLA-DQA1等位基因多態(tài)性與結(jié)核發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)明顯的關(guān)聯(lián)。第二部分基于i TRAQ標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病血清潛在標(biāo)志物目的:應(yīng)用相對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選肺結(jié)核病與對(duì)照組血清中的差異表達(dá)蛋白并驗(yàn)證潛在標(biāo)志物,為肺結(jié)核病防控提供有價(jià)值的血清候選標(biāo)志物。方法:采用相對(duì)和絕對(duì)定量的穩(wěn)定同位素(isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ)標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)分析五組樣本的血清蛋白組,即7例耐多藥肺結(jié)核病(multi-drug resistant pulmonary tuberculosis,MDR-PTB)、30例涂陰肺結(jié)核病(smear-negative pulmonary tuberculosis,SNP-TB)、10例涂陽(yáng)肺結(jié)核病(smear-positive pulmonary tuberculosis,SPP-TB)、30例健康對(duì)照和10例肺炎血清差異表達(dá)蛋白;生物信息學(xué)分析差異蛋白的功能;對(duì)潛在標(biāo)志物SHBG蛋白表達(dá)水平進(jìn)行系列驗(yàn)證,包括應(yīng)用免疫組化(Immunohistochemistry,IHC)驗(yàn)證40例肺結(jié)核病和10例對(duì)照組織,ELISA驗(yàn)證24例健康對(duì)照、35例耐多藥肺結(jié)核病、55例涂陽(yáng)肺結(jié)核病、70例涂陰肺結(jié)核病和15例肺炎的血清標(biāo)本,Western Blot驗(yàn)證30例健康對(duì)照、7例耐多藥肺結(jié)核病、10例涂陽(yáng)肺結(jié)核病、30例涂陰肺結(jié)核病和10例肺炎的血清標(biāo)本。根據(jù)ELISA的結(jié)果繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)并分析相關(guān)指標(biāo)。研究結(jié)果:相對(duì)定量蛋白組學(xué)共鑒定和篩選出肺結(jié)核病血清26個(gè)差異表達(dá)蛋白(包括16個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)和10個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá))。ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)SHBG蛋白在肺結(jié)核病中表達(dá)水平增高(耐多藥肺結(jié)核病組:181.76±200.09 nmol/L、涂陽(yáng)肺結(jié)核病組:160.43±75.45 nmol/L、涂陰肺結(jié)核病組:159.75±75.47 nmol/L、肺炎組:60.63±59.38 nmol/L、健康對(duì)照組:33.39±34.24 nmol/L;p0.0001),IHC和Western Blot方法的驗(yàn)證結(jié)果也表明SHBG蛋白在肺結(jié)核病中表達(dá)水平增高(p0.05),三種驗(yàn)證方法的表達(dá)趨勢(shì)與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果完全一致。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)SHBG蛋白鑒別肺結(jié)核病與肺炎、健康對(duì)照的準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性和AUC分別為78.74%、75.6%、91.53%和0.981。結(jié)論:建立蛋白組學(xué)篩選和鑒定肺結(jié)核病血清差異表達(dá)蛋白的技術(shù)平臺(tái);血清SHBG蛋白鑒別肺結(jié)核病與肺炎、健康對(duì)照的具有較高準(zhǔn)確性、靈敏度和特異度;是肺結(jié)核病防控有價(jià)值的血清候選標(biāo)志物。第三部分基于i TRAQ標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核病血清潛在標(biāo)志物目的:應(yīng)用相對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選耐多藥肺結(jié)核病與對(duì)照血清中的差異表達(dá)蛋白,進(jìn)一步應(yīng)用ELISA和質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)技術(shù)驗(yàn)證潛在的標(biāo)志物。方法:采用i TRAQ標(biāo)記結(jié)合MALDI-TOF-MS技術(shù)分析四組血清樣本的蛋白,包括7例耐多藥肺結(jié)核病、30例涂陰肺結(jié)核病、30例健康對(duì)照組和10例肺炎組,并通過(guò)Proteinpilot軟件篩選與鑒定耐多藥肺結(jié)核病相關(guān)的差異蛋白;應(yīng)用生物信息學(xué)分析顯著差異蛋白的細(xì)胞成分、分子功能和生物過(guò)程;對(duì)潛在標(biāo)志物TBA3E、纖連蛋白(Fibronectin 1,FN1)和玻連蛋白(Vitronectin,VTN)的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證,ELISA驗(yàn)證19例健康對(duì)照、15例肺炎、22例涂陰肺結(jié)核病和13例耐多藥肺結(jié)核病血清標(biāo)本中TBA3E蛋白表達(dá)水平;以及26例健康對(duì)照、26例肺炎、25例涂陰肺結(jié)核病和27例耐多藥肺結(jié)核病血清標(biāo)本中VTN表達(dá)水平;MRM技術(shù)驗(yàn)證蛋白VTN和FN1在10例健康對(duì)照、10例肺炎、10例涂陰肺結(jié)核病和10例耐多藥肺結(jié)核病血清標(biāo)本表達(dá)水平。繪制ROC曲線并分析相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果:比較涂陰肺結(jié)核病、健康對(duì)照、肺炎血清蛋白組,在耐多藥肺結(jié)核病血清中共鑒定和篩選出17個(gè)差異表達(dá)蛋白(包括9個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)和8個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá))。經(jīng)ELISA方法分析發(fā)現(xiàn)TBA3E蛋白在耐多藥肺結(jié)核病中表達(dá)水平增高(耐多藥肺結(jié)核病組:311.31±161.73μg/ml、涂陰肺結(jié)核病組:6.17±6.29μg/ml、肺炎組:6.38±7.72μg/ml、健康對(duì)照組:53.73±20.05μg/ml;p0.0001),表達(dá)趨勢(shì)與i TRAQ的結(jié)果完全一致。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)TBA3E蛋白鑒別耐多藥肺結(jié)核病與肺炎、健康對(duì)照、涂陰肺結(jié)核病的準(zhǔn)確性、靈敏性、特異性和AUC為91.07%、84.6%、94.6%和0.949。經(jīng)MRM分析發(fā)現(xiàn)蛋白FN1和VTN在耐多藥肺結(jié)核病中表達(dá)水平降低,表達(dá)趨勢(shì)與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果完全一致,但VTN蛋白的ELISA結(jié)果與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果不一致。結(jié)論:TBA3E蛋白鑒別耐多藥肺結(jié)核病與涂陰肺結(jié)核病、肺炎、健康對(duì)照的具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏度和特異度;可能是耐多藥肺結(jié)核病候選的血清標(biāo)志物;FN1蛋白和VTN蛋白是否是耐多藥肺結(jié)核病的潛在生物學(xué)標(biāo)志物需要進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R52
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本文編號(hào)：2326052