發(fā)布時(shí)間：2018-11-07 19:28

【摘要】：丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是引發(fā)慢性肝病的主要病原體。全球約有3％的人口感染HCV，每年約有35萬(wàn)人死于HCV相關(guān)的終末期肝病及其并發(fā)癥。因此，HCV感染已成為全球矚目的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前聚乙二醇化的α-干擾素聯(lián)合利巴韋林用藥是慢性丙型肝炎的標(biāo)準(zhǔn)治療方案，然而這種方案不僅費(fèi)用昂貴，僅有約50%的人有效，而且副作用大，患者常常不能耐受和堅(jiān)持治療。因此，急需從多途徑探索對(duì)HCV感染的預(yù)防和治療方法，其中研發(fā)有效疫苗對(duì)降低HCV感染及相關(guān)肝病的發(fā)病率具有重要意義。 有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答在控制HCV感染中起著十分重要的作用，，因此近年來(lái)以誘導(dǎo)高水平細(xì)胞免疫應(yīng)答為目的的疫苗設(shè)計(jì)策略備受重視。HCV T細(xì)胞表位主要集中在Core、NS3、NS4B、NS5A和NS5B蛋白上，以此為基礎(chǔ)的多表位疫苗是新型HCV疫苗研制的一個(gè)重要方向。基于構(gòu)建安全、覆蓋人群更為廣泛的預(yù)防/治療性疫苗的理念，本研究選擇了位于HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A、NS4B保守區(qū)域的2個(gè)CTL表位和Core蛋白上的一個(gè)通用Th表位，設(shè)計(jì)和合成了不同表位及其順序組合的8條表位肽，并對(duì)其誘導(dǎo)HHD-2小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力進(jìn)行了比較研究；進(jìn)而將免疫效果最佳的多表位肽VAL-44基因與HCV的NS3截短體基因以及樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）活化分子EDA基因融合，獲得了純化的EDA-ΔNS3-VAL-44重組蛋白，并研究了其誘導(dǎo)HHD-2小鼠特異性免疫應(yīng)答的效果。 【主要實(shí)驗(yàn)方法和研究結(jié)果】 1. HCV多表位肽的設(shè)計(jì)合成及其誘導(dǎo)HHD-2小鼠的免疫應(yīng)答 根據(jù)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位與HLA結(jié)合能力（我國(guó)人口中約50%為HLA-A2亞型）、與小鼠H2結(jié)合能力、所覆蓋的病毒基因型等綜合因素，借助生物信息學(xué)分析，選取了2個(gè)評(píng)分最高的HCV CTL表位，即NS5A1991~1999（VLSDFKVWL）以及NS4B1793~1801（SMMAFSAAL），再加入一個(gè)Th表位，即Core23~44（KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL），進(jìn)行了不同的排列組合，并輔以2個(gè)賴氨酸（Lysine-lysine，KK）作為間隔序列，通過(guò)固相多肽合成儀共合成8條不同組合方式的多肽（詳見(jiàn)下列）。質(zhì)譜測(cè)序結(jié)果表明，多肽的純度均在95%以上。 VL-44（NS5A1991~1999-KK-NS4B1793~1801-KK-Core23~44） SL-44（NS4B1793~1801-KK-NS5A1991~1999-KK-Core23~44） VAL-44（NS5A1991~1999-KK-Core23~44-KK-NS4B1793~1801） SWL-44（NS4B1793~1801-KK-Core23~44-KK-NS5A1991~1999） KWL-44（Core23~44-KK-NS4B1793~1801-KK-NS5A1991~1999） KAL-44（Core23~44-KK-NS5A1991~1999-KK-NS4B1793~1801） VL-20（NS5A1991~1999-KK-NS4B1793~1801） SL-20（NS4B1793~1801-KK-NS5A1991~1999） 取6~8周齡的HHD-2小鼠（該小鼠敲除了β2微球蛋白以及MHC I類分子，轉(zhuǎn)入表達(dá)人HLA-A2基因的αl、α2結(jié)構(gòu)域、人β2微球蛋白基因）54只，隨機(jī)分為9組，分別用上述8個(gè)多肽進(jìn)行免疫，并設(shè)PBS為對(duì)照組。免疫方案：將上述多肽分別與弗氏佐劑等體積充分混勻乳化后，經(jīng)皮下注射給小鼠，100μg/200μl/只；間隔2周加強(qiáng)免疫一次，共免疫3次；其中第一次免疫用弗氏完全佐劑，后兩次免疫用弗氏不完全佐劑。PBS對(duì)照組以上述同樣方式免疫3次。 采用多種方法對(duì)上述各組免疫小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行了檢測(cè)：1）脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，VAL-44、SWL-44、KWL-44這3個(gè)多肽免疫均能夠明顯刺激小鼠的脾細(xì)胞增殖（P＜0.05），其中以VAL-44的促進(jìn)作用最強(qiáng)；2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，VAL-44免疫組小鼠的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分比均明顯高于PBS對(duì)照組（P＜0.05）；3）ELISpot檢測(cè)的結(jié)果顯示，VAL-44、KWL-44、SWL-44這3個(gè)多肽免疫組小鼠分泌IL-2的脾細(xì)胞頻數(shù)均顯著高于PBS對(duì)照組（P＜0.05），其中以VAL-44免疫組的數(shù)值最高；VAL-44、KWL-44、SWL-44、VL-20這4個(gè)多肽免疫組小鼠分泌IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)均顯著高于PBS對(duì)照組（P＜0.05），其中亦以VAL-44免疫組的數(shù)值最高；4）CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VAL-44、KWL-44、VL-20、SWL-44這4個(gè)多肽誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)均顯著高于PBS對(duì)照組（P＜0.05），其中以VAL-44免疫組的殺傷效應(yīng)最強(qiáng)。 對(duì)上述VAL-44、SWL-44、KWL-44、VL-20等4種有效表位肽與T2細(xì)胞表面的HLA-A*0201分子的相對(duì)親和力及其穩(wěn)定性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，VAL-44和VL-20與HLA-A2具有較高的親和力；而且其解離時(shí)間（DC50）均大于6h，顯示穩(wěn)定性良好。 上述結(jié)果表明，在本研究選擇HCV2個(gè)CTL表位和1個(gè)通用Th表位所構(gòu)建的8個(gè)多表位肽中，以VAL-44多肽誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力最強(qiáng)，免疫效果最好。 2. EDA-ΔNS3-VAL-44重組蛋白的制備及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答 為進(jìn)一步增強(qiáng)多表位肽VAL-44的免疫原性和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的效果，我們將DC活化分子EDA以及HCV NS3截短體（ΔNS3）的基因相連接（EDA-ΔNS3基因），并將該基因插入到多表位肽VAL-44基因的上游，構(gòu)建了pET-32a-EDA-ΔNS3-VAL-44原核表達(dá)載體，同時(shí)構(gòu)建了含上述不同基因片段的pET-32a-EDA、pET-32a-EDA-ΔNS3和pET-32a-ΔNS3等原核表達(dá)載體，酶切、測(cè)序鑒定正確后，分別在E.coli中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE分析，所表達(dá)的各重組蛋白與預(yù)期分子量一致，Western-blot進(jìn)一步證實(shí)了表達(dá)蛋白的特異性；通過(guò)親和色譜技術(shù)在活性條件下分別進(jìn)行純化，得到了EDA-ΔNS3-VAL-44、EDA-ΔNS3、ΔNS3、EDA等4種重組蛋白。 取6~8周齡HHD-2小鼠36只，隨機(jī)分為6組，即上述4種重組蛋白分別免疫組、EDA-ΔNS3-VAL-44DNA聯(lián)合重組蛋白免疫組和PBS對(duì)照組。免疫方案：4種純化的重組蛋白均按100μg/只以及poly(I:C)50μg/只的量分別與弗氏佐劑等體積充分混勻乳化后，經(jīng)皮下注射給小鼠；間隔2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共免疫3次；PBS對(duì)照組采用上述同樣方式注射PBS3次；EDA-ΔNS3-VAL-44DNA聯(lián)合重組蛋白組的前兩次免疫（間隔2周）采用pIRES2-dsRED-EDA-ΔNS3-VAL-44質(zhì)粒DNA經(jīng)肌肉注射給小鼠，75μg/只；間隔2周后再用EDA-ΔNS3-VAL-44重組蛋白免疫一次，方法和劑量同前述各重組蛋白免疫組。 初次免疫后第2、4、6周，各組小鼠經(jīng)尾靜脈采血，分離血清，采用ELISA方法分別檢測(cè)血清中的特異性抗體以及IgG2a/IgG1的比值。結(jié)果顯示，各重組蛋白免疫小鼠的特異性抗體效價(jià)均隨著免疫時(shí)間及次數(shù)的增加而逐漸升高，其中EDA-ΔNS3-VAL-44免疫組抗體效價(jià)在各組中最高，首次免疫后第4周即達(dá)到1:12800；而且EDA-ΔNS3-VAL-44免疫組小鼠血清中的IgG2a/IgG1比值也是各組中最高的，表明該重組蛋白在整個(gè)免疫過(guò)程中主要以刺激產(chǎn)生IgG2a為主。 末次免疫后2周將各組小鼠處死，無(wú)菌取脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，并采用不同方法對(duì)其細(xì)胞免疫應(yīng)答水平進(jìn)行檢測(cè)：1）脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，EDA-ΔNS3-VAL-44免疫可明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖（與PBS組相比P＜0.05）；2）流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果顯示，EDA-ΔNS3-VAL-44免疫組小鼠的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分比均明顯高于其他各免疫組（P＜0.05）；3）ELISpot檢測(cè)的結(jié)果顯示，EDA-ΔNS3-VAL-44、EDA-ΔNS3、EDA-ΔNS3-VAL-44DNA聯(lián)合重組蛋白這3個(gè)免疫組小鼠分泌IL-2、IL-4及IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)均顯著高于PBS對(duì)照組（P＜0.05），且均以EDA-ΔNS3-VAL-44免疫組的數(shù)值最高。3個(gè)免疫組分泌IL-2及IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)增加均比分泌IL-4的脾細(xì)胞頻數(shù)增加明顯；4）各重組蛋白以及EDA-ΔNS3-VAL-44DNA聯(lián)合重組蛋白免疫均可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性殺傷作用（P＜0.05），其中EDA-ΔNS3-VAL-44免疫誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)顯著高于其他各組（P＜0.05）。 為進(jìn)一步評(píng)價(jià)各融合蛋白免疫小鼠體內(nèi)的CTL殺傷效果，借助實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了經(jīng)水動(dòng)力注射pIRES2-dsRED-EDA-ΔNS3-VAL-44質(zhì)粒后各組免疫小鼠肝臟中的EDA-ΔNS3-VAL-44基因（mRNA）水平，結(jié)果顯示EDA-ΔNS3-VAL-44基因在EDA-ΔNS3-VAL-44重組蛋白免疫組的表達(dá)量顯著低于其他各免疫組（P＜0.05），表明該重組蛋白誘導(dǎo)的CTL效應(yīng)可以顯著殺傷靶肝細(xì)胞。 【結(jié)論】 在本研究設(shè)計(jì)合成的8條HCV多表位肽中，以VAL-44（其氨基酸序列為：VLSDFKVWL-KK-KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRL-KK-SMMAFSAAL）誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力最強(qiáng)，免疫效果最好。將VAL-44多表位肽基因與HCV的NS3截短體基因以及DC活化分子EDA基因融合并誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的純化EDA-ΔNS3-VAL-44重組蛋白可誘導(dǎo)HHD-2小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答，其免疫效果明顯優(yōu)于各單個(gè)蛋白的免疫效果；另外還初步證明了該重組蛋白免疫誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的CTL可殺傷小鼠體內(nèi)的靶肝細(xì)胞。展示出該多表位重組蛋白具有預(yù)防和治療HCV感染的良好潛質(zhì)，值得進(jìn)一步深入研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2317349