【摘要】：白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen14, CD14)是參與脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子釋放的重要分子之一,它也是布魯氏菌細(xì)胞壁主要成分LPS的受體。microRNA(miRNA)是一類(lèi)非編碼的RNA,它參與到生命活動(dòng)的許多進(jìn)程中,如細(xì)胞增殖、凋亡、病毒防御和細(xì)菌感染等。研究表明：CD14基因沉默可以有效抑制LPS刺激條件下腫瘤壞死因子a(TNF-a)、趨化因子配體2(MIP-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。 該研究以本課題組雷明等人構(gòu)建的mCD14knockdown RAW264.7(224.3)細(xì)胞為基礎(chǔ),運(yùn)用miRNA基因芯片和qRT-PCR技術(shù)分析CD14沉默條件下miRNAs的差異表達(dá)；利用B.melitensis M5-90LPS刺激224.3細(xì)胞,分析B.melitensis M5-90LPS對(duì)miRNAs的影響；利用生物信息學(xué)軟件和Gene Ontology對(duì)差異表達(dá)miRNAs的潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)并分類(lèi)；利用qRT-PCR. Western blot和雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),對(duì)B.melitensis M5-90感染224.3細(xì)胞后差異變化miR-199a-3p調(diào)控靶基因的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。 結(jié)果表明：與對(duì)照細(xì)胞相比,在224.3細(xì)胞中,mmu-miR-199a-3p、 mmu-miR-199a-5p和mmu-miR-21-5p表達(dá)上調(diào)；在B.melitensisM5-90LPS刺激224.3細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),mmu-miR-199a-3p和mmu-miR-199a-5p表達(dá)上調(diào),但與未刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比,mmu-miR-199a-3p的上調(diào)水平明顯降低；利用四個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)miRNAs的靶基因進(jìn)行生物學(xué)預(yù)測(cè),并通過(guò)Gene Ontology對(duì)靶基因進(jìn)行分類(lèi)；在B.melitensis M5-90感染224.3細(xì)胞后,Cbl-b基因表達(dá)下調(diào),在mRNA水平和蛋白水平的驗(yàn)證結(jié)果一致；通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),構(gòu)建含有靶位點(diǎn)的熒光素酶載體與miR-199a-3p模擬物共同轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,可以顯著抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶活性,這些結(jié)果初步證實(shí)了在B.melitensis M5-90感染224.3細(xì)胞內(nèi),miR-199a-3p可以靶向調(diào)控Cbl-b的表達(dá)。這些結(jié)論為研究通過(guò)抑制上游炎癥通路以減弱損傷性炎癥反應(yīng)的作用機(jī)理提供了重要信息,同時(shí)為探索布魯氏菌病致病機(jī)理提供了重要的理論依據(jù)。
[Abstract]:Leukocyte differentiation antigen (14 (cluster of differentiation antigen14, CD14) is one of the important molecules involved in the release of inflammatory cytokines induced by lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS). It is also the receptor. MicroRNA (miRNA) of LPS, the main component of Brucella cell wall, which is a kind of non-coding RNA,. It is involved in many life processes, such as cell proliferation, apoptosis, virus defense and bacterial infection. CD14 gene silencing can effectively inhibit the production of tumor necrosis factor a (TNF-a), chemokine ligand 2 (MIP-2), interleukin-6 (IL-6) and nitric oxide (NO) (NO) stimulated by LPS. On the basis of mCD14knockdown RAW264.7 (224.3) cells constructed by Lei Ming et al., the differential expression of miRNAs under CD14 silencing condition was analyzed by miRNA gene chip and qRT-PCR technique. Using B.melitensis M5-90LPS to stimulate 224.3 cells to analyze the effect of B.melitensis M5-90LPS on miRNAs; using bioinformatics software and Gene Ontology to predict and classify the potential target genes for differentially expressed miRNAs; and using qRT-PCR. Western blot and double luciferase reporter gene technique were used to study the mechanism of differential change of miR-199a-3p regulatory target gene in 224.3 cells infected with B.melitensis M5-90. The results showed that the expression of mmu-miR-199a-3p, mmu-miR-199a-5p and mmu-miR-21-5p was up-regulated in 224.3 cells compared with control cells. The expression of mmu-miR-199a-3p and mmu-miR-199a-5p was up-regulated in 224.3 cells stimulated by B.melitensisM5-90LPS, but the up-regulation level of mmu-miR-199a-3p was significantly lower than that of unstimulated cells. The target genes of differentially expressed miRNAs were predicted by four online databases, and the target genes were classified by Gene Ontology. After B.melitensis M5-90 was infected with 224.3 cells, the expression of Cbl-b gene was down-regulated, and the results were consistent at the level of mRNA and protein. Through luciferase experiment, we found that the construction of luciferase vector containing target sites and miR-199a-3p mimics can significantly inhibit the luciferase activity of firefly. These results suggest that miR-199a-3p can target the expression of Cbl-b in 224.3 cells infected with B.melitensis M5-90. These conclusions provide important information for the study of the mechanism of inhibiting the upstream inflammatory pathway and provide important theoretical basis for exploring the pathogenetic mechanism of brucellosis.
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R516.7

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本文編號(hào)：2310875