【摘要】：研究目的 乙型重型肝炎病死率高,預后差。尋找可用于早期預示和早期診斷重型肝炎發(fā)生的分子標志物是目前病毒性肝炎研究的熱點之一。越來越多的證據表明循環(huán)microRNAs (cir-miRNAs)可能作為潛在的疾病診斷生物標志物。本課題旨在研究乙型肝炎重癥化過程中血清1miRNA表達譜的變化以篩選差異表達的microRNA-210(miRNA-210).評價血清miR-210水平與乙型肝炎重癥化進程的關聯(lián)關系、探討miR-210在乙型肝炎重癥化過程中的潛在功能及其作用機制,為乙型肝炎重癥化的早期預測、預防和治療提供新型靶標。 研究方法 1miRNA芯片實驗 (1) miRNA表達譜分析： 用TaqMan(?) Human MicroRNA Array A分析健康人混合血清樣本(10例等體積混合)、慢乙肝輕度病人混合血清樣本(10例等體積混合)、乙型慢加急肝衰竭病人混合血清樣本(10例等體積混合)的miRNAs表達譜。 (2)篩選差異表達]miRNAs: 以(Ct35)且(|△△Ct|≥2)為判定標準,初步篩選可擴增檢測到的差異表達的1miRNAs。 (3)候選miR-210的選擇：以(Ct35)且(△△Ct≤-2)為判定標準,進一步篩選隨著乙型肝炎病情嚴 重程度表達水平升高的miR-210用于單樣本RT-qPCR驗證。 2人群調查 (1)血清樣本：30例慢乙肝輕度病人血清、30例慢乙肝重度病人血清、30例乙型慢加急肝 衰竭病人血清及30例健康對照血清。 (2)miR-210的再驗證：針對miRNA芯片篩選出來的差異表達的miR-210進行單樣本RT-qPCR驗證。 (3)其他檢測指標：肝功能(ALT、AST、TBIL、PTA),血清HBV標記物,病毒載量。 3動物實驗經小鼠尾靜脈注射Con A (20mg/kg)制備小鼠急性肝衰竭模型，并于注射后 6、12、24小時處死動物,收集外周血和肝組織,檢測下列指標： (1)缺氧探針染色：檢測缺氧肝細胞。 (2)熒光定量PCR：檢測肝組織和血清miR-210水平。 (3)熒光定量PCR：檢測小鼠肝組織miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA水平。 4.體外實驗 HepG2.2.15細胞分別轉染空白對照(DEPC水)、模擬物陰性對照和miR-210模擬物后,缺氧培養(yǎng)24h或48h后檢測下列指標： (1) CCK8assay:檢測HepG2.2.15細胞線粒體脫氫酶活性。 (2)病毒學指標檢測：培養(yǎng)基上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA拷貝數；HepG2.2.15細胞內HBsAg mRNA水平。 研究結果 1miRNA芯片實驗結果 (1)血清中可檢測到miRNA的數量和表達水平隨著病情進展顯著增加。 (2)乙型肝炎病人血清let-7b等20個miRNAs表達水平顯著高于健康對照組。 (3)血清中miR-210、miR-324-5p、miR-423-5p表達水平隨著病情進展顯著升高。 2人群調查結果 (1)輕/重度乙型肝炎和乙型慢加急肝衰竭病人血清中miR-210的水平顯著高于健康對照組(P0.05),血清中miR-210表達水平隨著乙型肝炎病情進展顯著性升高。 (2)慢性乙型肝炎患者血清miR-210水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平呈正相關(P0.05),與凝血酶原活動度呈負相關(P0.05)。 3動物實驗結果 (1)小鼠肝衰竭進程存在動態(tài)缺氧現象。Con A暴露6h組和12h組小鼠肝細胞缺氧率顯著性增加(P0.05),Con A暴露24h組小鼠肝細胞缺氧率顯著高于Oh組(P0.05),但低于6h和12h組(P0.05)。 (2)小鼠肝組織和血清miR-210表達水平隨著病情進展顯著升高。 (3)小鼠肝衰竭進程miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA表達水平顯著性減少(P0.05)。 4細胞實驗結果 (1)缺氧條件下miR-210過表達抑制HepG2.2.15細胞線粒體脫氫酶活性。 (2)缺氧條件下miR-210過表達抑制HBV DNA復制和HBsAg表達。 研究結論 1.miRNA表達譜芯片結果顯示：乙型肝炎重癥化進程血清中miRNA的數量和表達水平與乙型肝炎病情嚴重程度有關。 2.肝炎病人調查顯示：miR-210對乙型肝炎重癥化進程有重要的提示作用,miR-210對乙型肝炎重癥化的早期診斷有重要意義。 3.肝炎病人miR-210表達水平升高的內在機制是炎癥導致肝細胞缺氧,進而誘導miR-210表達。 4.通過調節(jié)線粒體代謝,miR-210在乙型肝炎重癥化進程中可能起著重要的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.62

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本文編號：2302726