【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的較為古老的自然疫源性傳染病。發(fā)病后死亡率高達(dá)100%�？袢《緦儆趶棤畈《究瓶袢《緦�,是單股負(fù)鏈RNA。主要編碼五種結(jié)構(gòu)蛋白,核蛋白(N),磷蛋白(P),膜蛋白(M),糖蛋白(G)和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白(L)。作為最早巴斯德開發(fā)出的病毒疫苗,狂犬疫苗的制備與使用已相對成熟。然而,對狂犬病的治療至今尚無有效的方法,對狂犬病毒感染及早有效檢測,監(jiān)測實驗動物和野生動物自然感染及評價狂犬疫苗免疫效果,及時有效的隔離和處理已感染群體,是減少人員傷亡和經(jīng)濟(jì)損失的有效手段狂犬病毒磷蛋白占病毒蛋白總量的6%,為高度親水性蛋白。磷蛋白為病毒RNA聚合酶的輔助因子,是一種多功能蛋白,同時在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。磷蛋白可通過與STAT1互作,抑制干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,阻止病毒感染細(xì)胞的抗病毒反應(yīng),對抗宿主細(xì)胞的自身免疫反應(yīng),也是免疫反應(yīng)的重要調(diào)控因子。對狂犬病毒磷蛋白單鏈抗體的研究,在狂犬病毒的臨床診斷和治療中都有重要實際應(yīng)用意義。為對狂犬病毒重組磷蛋白進(jìn)行表達(dá)與純化,首先利用primer 5軟件,根據(jù)NCBI中檢索出的狂犬病毒磷蛋白基因序列,設(shè)計可擴(kuò)增引物兩端帶有EcoRI和SalII酶切位點的特異性引物。將擴(kuò)增的目的基因插入PET-32a表達(dá)載體,經(jīng)過PCR驗證和公司測序分析,獲得了陽性克隆�；蚪�(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE進(jìn)行蛋白檢測,結(jié)果表明重組蛋白大量表達(dá)在包涵體中,經(jīng)蛋白純化、復(fù)性、透析與真空冷凍干燥,可得到高濃度的狂犬病毒重組磷蛋白。ELISA和Western blot實驗結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白分子量為53KD,具有較好的抗原性。進(jìn)而,用獲得的重組磷蛋白免疫小鼠,取免疫成功的小鼠脾臟細(xì)胞,與生長狀態(tài)良好的小鼠骨髓瘤細(xì)胞的進(jìn)行細(xì)胞融合,使用間接ELISA和間接免疫熒光篩選雜交瘤細(xì)胞,并測定上清中抗體特異性與抗體濃度。最終我們獲得了一株分泌抗狂犬病毒磷蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株1A4。用該陽性雜交瘤細(xì)胞制備腹水,經(jīng)進(jìn)行純化和特異性檢測發(fā)現(xiàn),該細(xì)胞株所分泌抗體能有效識別狂犬病毒蛋白。最后,從陽性雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增分泌抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,并構(gòu)建狂犬病毒磷蛋白單鏈抗體的表達(dá)載體。在設(shè)計單鏈抗體表達(dá)載體時,我們在C末端加入了堿性磷酸酶基因,表達(dá)產(chǎn)物為單鏈抗體與堿性磷酸酶的融合蛋白,可以作為直接抗體,檢測時無需二抗,省時、省力、易于制備,生產(chǎn)成本大大降低。經(jīng)Western blot和間接免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),表達(dá)獲得的抗磷蛋白單鏈抗體有很好的狂犬病毒磷蛋白結(jié)合效果。經(jīng)對狂犬病臨床樣本初步檢測發(fā)現(xiàn),以最適用量的單鏈抗體,通過競爭性ELISA實驗有很好的檢測效果,制備的單鏈抗體具有較好的產(chǎn)品開發(fā)前景。本研究成功制備了狂犬病毒磷蛋白,并在此基礎(chǔ)上成功制備出特異性較高的的單克隆抗體和單鏈抗體。單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白作為直接抗體,不僅為實驗節(jié)省了時間和二抗材料,在抗體檢測應(yīng)用中,也打破傳統(tǒng)抗體商品化試劑盒在檢測物種上的限制,無需考慮因檢測對象差異需要配套相應(yīng)二抗的問題,為狂犬病毒診斷和動物免疫效果評價提供技術(shù)支持。
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【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.99

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2298589