高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠病理損傷特征及補體介導(dǎo)的免疫病理損傷機制研究
發(fā)布時間:2018-10-19 20:01
【摘要】:目的:目前人高致病禽流感H5N1病毒引起的高病死率和新發(fā)人禽流感病毒的頻繁出現(xiàn)對公共衛(wèi)生提出了嚴峻挑戰(zhàn)。人禽流感病毒感染后的生理和病理特征仍需進一步探討,不同人禽流感病毒的感染損傷特征及宿主反應(yīng)分析仍需研究。此外,免疫病理損傷在人禽流感病毒感染致病中的分子機制仍然沒有充分系統(tǒng)的認識,尤其是對補體介導(dǎo)的免疫病理損傷作用及機制缺乏了解。為此,本研究建立高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型,同時對比分析H5N1、H7N9及H1N1病毒感染小鼠后的病理損傷特征及宿主反應(yīng)。此外應(yīng)用H5N1病毒感染小鼠模型系統(tǒng)闡明補體介導(dǎo)的免疫病理損傷的致病作用及分子機制,以期為防治新發(fā)人禽流感病毒及探索新的免疫治療策略等提供參考。 方法:(1)高致病性H5N1病毒感染小鼠模型建立:生物安全三級實驗室內(nèi)滴鼻感染20μl10LD50H5N1病毒感染小鼠,對照組同樣方法接種PBS。觀察小鼠生命狀態(tài)及體重變化、生存時間及存活率。感染后1天、3天和5天分別處死小鼠,檢測H5N1病毒感染組織嗜性及組織中病毒分布及滴度,蘇木素-伊紅(HE)染色檢測小鼠各組織病理變化;免疫組化技術(shù)檢測肺組織中性粒細胞表達及浸潤程度;ELISA技術(shù)檢測感染后血清白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)和肺組織勻漿液中的髓過氧化物酶(MPO)的表達變化;熒光實時定量PCR技術(shù)檢測肺組織中干擾素反應(yīng)水平變化。 (2)不同流感病毒感染小鼠損傷特征比較分析:利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型,對比分析各小鼠模型不同流感病毒感染后存活率和體重變化、分析小鼠組織病理損傷、病毒復(fù)制和抗原分布差異,感染后中性粒細胞表達變化,及免疫組化技術(shù)檢測增殖細胞核抗原(PCNA),旨在對比分析各流感病毒的致病性及以宿主針對不同流感病毒感染后的自身修復(fù)能力。 (3) H5N1病毒感染后補體激活研究:在H5N1病毒感染所致嚴重肺炎的小鼠模型中,分別使用免疫組化技術(shù)檢測補體成分C3和C5b-9在肺組織的沉積和補體受體C3aR和C5aR及凝集素途徑MBL-c成分的表達變化,使用熒光實時定量PCR技術(shù)檢測C3aR、C5aR和MBL激活相關(guān)絲氨酸蛋白2(MASP2)的轉(zhuǎn)錄水平的表達變化,以評價小鼠模型在H5N1病毒感染后補體的激活情況。 (4)抑制補體激活在H5N1病毒所致肺炎的保護作用研究:在H5N1病毒建立的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥(ALI/ARDS)模型中,分別使用眼鏡蛇毒因子(CVF)降低機體補體的整體水平,C3aR抑制劑(C3aRa)阻斷C3a與C3aR結(jié)合以及抗小鼠C5a抗體封閉C5a活性等方式抑制補體過度激活,實驗共分為4組:①CVF干預(yù)組:在感染前24h和48h分別腹腔注射CVF(2.5μg/只/次);②C3aRa阻斷組:在感染后立即尾靜脈注射C3aRa(1mg/kg);③Anti-C5a Ab阻斷組:在感染之后立即尾靜脈注射Anti-C5a Ab(400ug/只),④H5N1病毒感染未治療組。對比觀察各組小鼠存活率及生命狀態(tài),檢測小鼠肺組織病理損傷差異及炎癥細胞數(shù)量及炎癥因子及干擾素反應(yīng)水平差異,評價抑制補體激活在H5N1感染所致嚴重肺炎中的保護作用。 結(jié)果:(1)高致病性禽流感H5N1病毒感染小鼠模型研究。小鼠感染H5N1病毒后所呈現(xiàn)出的生命狀態(tài)、生理病理特征以及炎癥反應(yīng)均與臨床H5N1病毒感染患者的ALI/ARDS相似,主要體現(xiàn)為:小鼠活動力明顯減弱,體重減輕;出現(xiàn)倒毛、弓背等現(xiàn)象;從第7天開始死亡,10d內(nèi)小鼠全部死亡,死亡率達100%;在病毒感染小鼠之后能夠檢測病毒在肺組織存在并復(fù)制,感染早期存在于氣管和支氣管腔,晚期浸潤到肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi),多數(shù)小鼠腦內(nèi)也能分離到病毒。病毒感染后主要損傷器官為肺組織,感染早期肺支氣管上皮細胞脫落、壞死,感染后期肺組織出現(xiàn)彌漫性損傷,肺泡腔塌陷、組織大量充血水腫。感染后肺組織出現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng),中性粒細胞增多并且在感染后期浸潤到肺泡腔內(nèi),中性粒細胞分泌的MPO表達明顯增多,血清中致炎細胞因子IL-6和TNF-α也發(fā)生上調(diào),小鼠肺組織IFN-γ表達增強,IFN-α/β R表達水平下降。 (2)不同流感病毒感染小鼠損傷特征分析研究:利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型,對比分析不同流感病毒感染后的小鼠損傷特征,主要表現(xiàn)為:H7N9病毒感染后小鼠無死亡,H5N1和H1N1病毒感染后小鼠均全部死亡,但H5N1病毒小鼠存活時間更短;三種病毒抗原主要分布于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞和少量間質(zhì)細胞。H7N9病毒感染小鼠肺組織呈現(xiàn)脈管炎和間質(zhì)炎的病理特征,脾臟偶見輕微病變;而H5N1和H1N1病毒感染后小鼠肺組織呈現(xiàn)ARDS的典型病理特征,并且H5N1病毒的肺損傷更為嚴重,兩者脾臟炎細胞均明顯增多。H7N9病毒感染之后宿主炎癥反應(yīng)較小,感染后小鼠肺組織自我修復(fù)能力較強;H5N1和H1N1病毒感染小鼠后機體炎癥反應(yīng)強烈,感染后恢復(fù)能力差,其中H5N1病毒感染炎癥最為明顯,恢復(fù)能力最差。 (3)H5N1病毒感染小鼠后補體激活研究:H5N1病毒感染小鼠后小鼠補體成分C3和C5b-9在肺組織沉積明顯增多,補體受體C3aR和C5aR表達明顯上調(diào),其中感染早期補體成分及受體主要沉積和表達在支氣管腔上皮細胞,感染后期在肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞等大量沉積和表達,并且發(fā)現(xiàn)凝集素途徑中的MBL-c沉積及MBL活化相關(guān)的絲氨酸蛋白2的表達也明顯增強。使用實時定量PCR檢測到C3aR, C5aR和MASP2轉(zhuǎn)錄水平同樣在感染后升高,其中C5aR和MASP2升高更為明顯。提示補體在H5N1病毒感染后大量激活,其中凝集素途徑是重要的病毒感染后的補體激活途徑。 (4)抑制補體激活在H5N1病毒所致嚴重肺炎中的保護作用研究:分別使用CVF降低機體補體的整體水平,C3aRa阻斷C3a與C3aR結(jié)合以及抗小鼠Anti-C5aAb封閉C5a活性等方式抑制補體過度激活,與未治療組對比分析,在抑制補體激活之后,小鼠的存活時間明顯延長,死亡率降低,小鼠的活動力增強,生命狀態(tài)改善,治療后小鼠在感染后期均未出現(xiàn)嚴重肺炎的病理特征,僅出現(xiàn)肺間隔增寬,小灶性肺泡腔塌陷等。另外,抑制補體激活后有效降低H5N1病毒感染所致炎癥反應(yīng),主要體現(xiàn)為中性粒細胞浸潤程度降低,,肺組織MPO表達降低,血清中TNF-α因子下降及宿主II型干擾素反應(yīng)降低。以上結(jié)果提示抑制補體激活能夠降低炎癥反應(yīng),有效減輕H5N1病毒感染所致的肺組織病理損傷。 結(jié)論:本研究成功建立了高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型,并詳細評價感染后小鼠的病理生理特征和炎癥變化,同時對比分析了不同流感病毒的感染特征和損傷特征的差異,明確了流感病毒毒力及宿主反應(yīng)的差異。此外,應(yīng)用H5N1病毒感染小鼠模型闡明了補體介導(dǎo)的免疫病理損傷致病作用及分子機制,并采取不同的補體抑制方式探索基于補體為治療靶點的免疫治療策略研究。該研究為探討人禽流感病毒感染損傷特征及致病機制,探索預(yù)防和治療新發(fā)人禽流感病毒的新的免疫治療策略研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號】:R511.7
本文編號:2282205
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】:碩士
【學(xué)位授予年份】:2014
【分類號】:R511.7
【參考文獻】
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1 廖偉嬌,黎毅敏,陳濤,何為群,林勇平,李寧;嚴重急性呼吸綜合征患者血清急性時相反應(yīng)蛋白的測定[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期
本文編號:2282205
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