【摘要】：目的:目前人高致病禽流感H5N1病毒引起的高病死率和新發(fā)人禽流感病毒的頻繁出現(xiàn)對(duì)公共衛(wèi)生提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。人禽流感病毒感染后的生理和病理特征仍需進(jìn)一步探討，不同人禽流感病毒的感染損傷特征及宿主反應(yīng)分析仍需研究。此外，免疫病理?yè)p傷在人禽流感病毒感染致病中的分子機(jī)制仍然沒(méi)有充分系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，尤其是對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷作用及機(jī)制缺乏了解。為此，本研究建立高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型，同時(shí)對(duì)比分析H5N1、H7N9及H1N1病毒感染小鼠后的病理?yè)p傷特征及宿主反應(yīng)。此外應(yīng)用H5N1病毒感染小鼠模型系統(tǒng)闡明補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷的致病作用及分子機(jī)制，以期為防治新發(fā)人禽流感病毒及探索新的免疫治療策略等提供參考。 方法:（1）高致病性H5N1病毒感染小鼠模型建立：生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)滴鼻感染20μl10LD50H5N1病毒感染小鼠，對(duì)照組同樣方法接種PBS。觀察小鼠生命狀態(tài)及體重變化、生存時(shí)間及存活率。感染后1天、3天和5天分別處死小鼠，檢測(cè)H5N1病毒感染組織嗜性及組織中病毒分布及滴度，蘇木素-伊紅（HE）染色檢測(cè)小鼠各組織病理變化；免疫組化技術(shù)檢測(cè)肺組織中性粒細(xì)胞表達(dá)及浸潤(rùn)程度；ELISA技術(shù)檢測(cè)感染后血清白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）和肺組織勻漿液中的髓過(guò)氧化物酶（MPO）的表達(dá)變化；熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織中干擾素反應(yīng)水平變化。 （2）不同流感病毒感染小鼠損傷特征比較分析：利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型，對(duì)比分析各小鼠模型不同流感病毒感染后存活率和體重變化、分析小鼠組織病理?yè)p傷、病毒復(fù)制和抗原分布差異，感染后中性粒細(xì)胞表達(dá)變化，及免疫組化技術(shù)檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA），旨在對(duì)比分析各流感病毒的致病性及以宿主針對(duì)不同流感病毒感染后的自身修復(fù)能力。 （3） H5N1病毒感染后補(bǔ)體激活研究：在H5N1病毒感染所致嚴(yán)重肺炎的小鼠模型中，分別使用免疫組化技術(shù)檢測(cè)補(bǔ)體成分C3和C5b-9在肺組織的沉積和補(bǔ)體受體C3aR和C5aR及凝集素途徑MBL-c成分的表達(dá)變化，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)C3aR、C5aR和MBL激活相關(guān)絲氨酸蛋白2（MASP2）的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化，以評(píng)價(jià)小鼠模型在H5N1病毒感染后補(bǔ)體的激活情況。 （4）抑制補(bǔ)體激活在H5N1病毒所致肺炎的保護(hù)作用研究：在H5N1病毒建立的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥（ALI/ARDS）模型中，分別使用眼鏡蛇毒因子（CVF）降低機(jī)體補(bǔ)體的整體水平，C3aR抑制劑（C3aRa）阻斷C3a與C3aR結(jié)合以及抗小鼠C5a抗體封閉C5a活性等方式抑制補(bǔ)體過(guò)度激活，實(shí)驗(yàn)共分為4組：①CVF干預(yù)組：在感染前24h和48h分別腹腔注射CVF（2.5μg/只/次）；②C3aRa阻斷組：在感染后立即尾靜脈注射C3aRa（1mg/kg）；③Anti-C5a Ab阻斷組：在感染之后立即尾靜脈注射Anti-C5a Ab（400ug/只），④H5N1病毒感染未治療組。對(duì)比觀察各組小鼠存活率及生命狀態(tài)，檢測(cè)小鼠肺組織病理?yè)p傷差異及炎癥細(xì)胞數(shù)量及炎癥因子及干擾素反應(yīng)水平差異，評(píng)價(jià)抑制補(bǔ)體激活在H5N1感染所致嚴(yán)重肺炎中的保護(hù)作用。 結(jié)果：（1）高致病性禽流感H5N1病毒感染小鼠模型研究。小鼠感染H5N1病毒后所呈現(xiàn)出的生命狀態(tài)、生理病理特征以及炎癥反應(yīng)均與臨床H5N1病毒感染患者的ALI/ARDS相似，主要體現(xiàn)為：小鼠活動(dòng)力明顯減弱，體重減輕；出現(xiàn)倒毛、弓背等現(xiàn)象；從第7天開(kāi)始死亡，10d內(nèi)小鼠全部死亡，死亡率達(dá)100%；在病毒感染小鼠之后能夠檢測(cè)病毒在肺組織存在并復(fù)制，感染早期存在于氣管和支氣管腔，晚期浸潤(rùn)到肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)，多數(shù)小鼠腦內(nèi)也能分離到病毒。病毒感染后主要損傷器官為肺組織，感染早期肺支氣管上皮細(xì)胞脫落、壞死，感染后期肺組織出現(xiàn)彌漫性損傷，肺泡腔塌陷、組織大量充血水腫。感染后肺組織出現(xiàn)顯著的炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞增多并且在感染后期浸潤(rùn)到肺泡腔內(nèi)，中性粒細(xì)胞分泌的MPO表達(dá)明顯增多，血清中致炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α也發(fā)生上調(diào)，小鼠肺組織IFN-γ表達(dá)增強(qiáng)，IFN-α/β R表達(dá)水平下降。 （2）不同流感病毒感染小鼠損傷特征分析研究：利用H5N1、H7N9禽流感病毒和H1N1流感病毒感染小鼠模型，對(duì)比分析不同流感病毒感染后的小鼠損傷特征，主要表現(xiàn)為：H7N9病毒感染后小鼠無(wú)死亡，H5N1和H1N1病毒感染后小鼠均全部死亡，但H5N1病毒小鼠存活時(shí)間更短；三種病毒抗原主要分布于支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和少量間質(zhì)細(xì)胞。H7N9病毒感染小鼠肺組織呈現(xiàn)脈管炎和間質(zhì)炎的病理特征，脾臟偶見(jiàn)輕微病變；而H5N1和H1N1病毒感染后小鼠肺組織呈現(xiàn)ARDS的典型病理特征，并且H5N1病毒的肺損傷更為嚴(yán)重，兩者脾臟炎細(xì)胞均明顯增多。H7N9病毒感染之后宿主炎癥反應(yīng)較小，感染后小鼠肺組織自我修復(fù)能力較強(qiáng)；H5N1和H1N1病毒感染小鼠后機(jī)體炎癥反應(yīng)強(qiáng)烈，感染后恢復(fù)能力差，其中H5N1病毒感染炎癥最為明顯，恢復(fù)能力最差。 （3）H5N1病毒感染小鼠后補(bǔ)體激活研究：H5N1病毒感染小鼠后小鼠補(bǔ)體成分C3和C5b-9在肺組織沉積明顯增多，補(bǔ)體受體C3aR和C5aR表達(dá)明顯上調(diào)，其中感染早期補(bǔ)體成分及受體主要沉積和表達(dá)在支氣管腔上皮細(xì)胞，感染后期在肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等大量沉積和表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)凝集素途徑中的MBL-c沉積及MBL活化相關(guān)的絲氨酸蛋白2的表達(dá)也明顯增強(qiáng)。使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)到C3aR, C5aR和MASP2轉(zhuǎn)錄水平同樣在感染后升高，其中C5aR和MASP2升高更為明顯。提示補(bǔ)體在H5N1病毒感染后大量激活，其中凝集素途徑是重要的病毒感染后的補(bǔ)體激活途徑。 （4）抑制補(bǔ)體激活在H5N1病毒所致嚴(yán)重肺炎中的保護(hù)作用研究：分別使用CVF降低機(jī)體補(bǔ)體的整體水平，C3aRa阻斷C3a與C3aR結(jié)合以及抗小鼠Anti-C5aAb封閉C5a活性等方式抑制補(bǔ)體過(guò)度激活，與未治療組對(duì)比分析，在抑制補(bǔ)體激活之后，小鼠的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，死亡率降低，小鼠的活動(dòng)力增強(qiáng)，生命狀態(tài)改善，治療后小鼠在感染后期均未出現(xiàn)嚴(yán)重肺炎的病理特征，僅出現(xiàn)肺間隔增寬，小灶性肺泡腔塌陷等。另外，抑制補(bǔ)體激活后有效降低H5N1病毒感染所致炎癥反應(yīng)，主要體現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低，，肺組織MPO表達(dá)降低，血清中TNF-α因子下降及宿主II型干擾素反應(yīng)降低。以上結(jié)果提示抑制補(bǔ)體激活能夠降低炎癥反應(yīng)，有效減輕H5N1病毒感染所致的肺組織病理?yè)p傷。 結(jié)論:本研究成功建立了高致病禽流感H5N1病毒感染小鼠模型，并詳細(xì)評(píng)價(jià)感染后小鼠的病理生理特征和炎癥變化，同時(shí)對(duì)比分析了不同流感病毒的感染特征和損傷特征的差異，明確了流感病毒毒力及宿主反應(yīng)的差異。此外，應(yīng)用H5N1病毒感染小鼠模型闡明了補(bǔ)體介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷致病作用及分子機(jī)制，并采取不同的補(bǔ)體抑制方式探索基于補(bǔ)體為治療靶點(diǎn)的免疫治療策略研究。該研究為探討人禽流感病毒感染損傷特征及致病機(jī)制，探索預(yù)防和治療新發(fā)人禽流感病毒的新的免疫治療策略研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R511.7

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 廖偉嬌,黎毅敏,陳濤,何為群,林勇平,李寧;嚴(yán)重急性呼吸綜合征患者血清急性時(shí)相反應(yīng)蛋白的測(cè)定[J];中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2004年02期

本文編號(hào)：2282205