【摘要】：背景： 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是一個(gè)世界性公共衛(wèi)生問題,調(diào)查顯示目前全球約有4億慢性HBV感染者,這些感染者具有潛在發(fā)展為肝硬化、肝癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。 慢性HBV感染自然史中,每年約有2-15%感染者能夠自發(fā)發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,長(zhǎng)期隨訪發(fā)現(xiàn)這些感染者往往成為穩(wěn)定的非活動(dòng)性HBsAg攜帶者(inactive carrier, IC),通過自身免疫應(yīng)答能夠有效控制病毒復(fù)制,抑制肝臟炎癥,其發(fā)生肝硬化、肝癌的風(fēng)險(xiǎn)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于HBeAg陽性的感染者。 對(duì)于已經(jīng)發(fā)生肝炎的慢性HBV感染者,目前國(guó)內(nèi)外的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)防治指南都指出：抗病毒治療是CHB患者最重要的治療手段,它能夠有效控制肝臟炎癥、阻止肝硬化的發(fā)生,進(jìn)一步改善患者生活質(zhì)量,提高生存率。乙肝病毒e抗原(HBeAg)陽性CHB患者進(jìn)行抗病毒治療,目前認(rèn)為較為滿意的治療終點(diǎn)是控制肝臟炎癥、抑制HBV DNA復(fù)制,并發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,即血清中HBeAg消失,同時(shí)出現(xiàn)能夠識(shí)別HBeAg的T細(xì)胞依賴性中和抗體即e抗體。而能夠發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的患者通常轉(zhuǎn)換為非活動(dòng)性HBsAg攜帶者。 目前,導(dǎo)致HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的病毒因素和宿主免疫機(jī)制尚未完全闡明,并且抗病毒治療中存在的一個(gè)重要問題：藥物能夠有效抑制病毒,控制肝臟炎癥,但并非所有患者都能達(dá)到HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換；一旦停止治療,往往出現(xiàn)高病毒載量的反彈,以及肝臟炎癥的復(fù)發(fā)。這一結(jié)果將使不能發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的CHB病人必須面對(duì)高昂的費(fèi)用,以及長(zhǎng)期用藥的不便。 白細(xì)胞介素-21(interleukin-21, IL-21)是I類細(xì)胞因子家族中的一員,其受體與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9以及IL-15的受體共用Y鏈。IL-21主要由CD4+T細(xì)胞的眾多亞群分泌,包括Th17細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞(TFH),以及NK T細(xì)胞等。IL-21能夠增強(qiáng)B細(xì)胞、T細(xì)胞以及NK細(xì)胞的免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)功能,故認(rèn)為其是連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁。 由小鼠模型建立的慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV)感染中,已證實(shí)IL-21能夠促進(jìn)功能耗竭的CD8+T細(xì)胞控制病毒,并且在有關(guān)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染的研究中,IL-21與CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)。另外在轉(zhuǎn)基因小鼠模型建立的急性HBV感染中,證實(shí)成年鼠能夠清除HBV,且其肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞分泌的IL-21顯著性高于幼年鼠,而IL-21能夠提升CD8+T細(xì)胞功能,促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體,最終有效清除病毒。 因目前并非所有使用抗病毒藥物患者都能產(chǎn)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,且IL-21在人慢性HBV感染中的作用尚未見明確報(bào)道,鑒于IL-21能夠增強(qiáng)T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答,本研究假設(shè)IL-21可能促進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的發(fā)生和機(jī)體對(duì)HBV的控制。 目的： 通過對(duì)慢性HBV感染自然史的橫向研究和HBeAg陽性CHB患者抗病毒治療的動(dòng)態(tài)觀察,檢測(cè)IL-21在血清蛋白水平、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平及外周血分泌細(xì)胞水平的表達(dá)情況,了解IL-21在慢性HBV感染中的變化規(guī)律,分析其與肝臟炎癥和病毒復(fù)制的相關(guān)性,特別是其與]HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系,并通過體外實(shí)驗(yàn)探索IL-21在慢性HBV感染中的作用,期望為CHB的診斷及療效預(yù)測(cè)尋找新的生物學(xué)標(biāo)志和潛在的免疫治療手段。 方法： 1.研究對(duì)象 橫向研究共納入119例受試者,其中包括免疫耐受期患者(immuno tolerant carrier, IT)20例,HBeAg陽性CHB患者58例,非活動(dòng)性攜帶者(inactive carrier,IC)21例,并選取20例健康人(healthy controls, HC)作為研究對(duì)照,不同慢性HBV感染者診斷標(biāo)準(zhǔn)主要參考中國(guó)慢性乙型肝炎防治指南2010年更新版。 IT納入標(biāo)準(zhǔn)為：在至少1年連續(xù)3次或以上隨訪中HBsAg陽性、HBeAgP日性,且血清ALT水平正常(1ULN)。IC納入標(biāo)準(zhǔn)為：在間隔至少6個(gè)月的兩次隨訪中,HBsAg陽性、HBeAg陰性、HBeAb陽性,血清ALT水平持續(xù)正常(1ULN),且HBV DNA定量10,000copies/mL。HBeAg陽性CHB患者納入標(biāo)準(zhǔn)為,血清HBsAg、HBeAg陽性、抗-HBe陰性,HBV DNA100,000copies/mL,且過期血清ALT持續(xù)或反復(fù)升高(1ULN)。健康志愿者20人,來源于南方醫(yī)院肝病中心實(shí)驗(yàn)室的工作人員或南方醫(yī)科大學(xué)在校學(xué)生,納入標(biāo)準(zhǔn)為：血清HBsAg陰性,且血清ALT水平正常(1ULN),無其他嚴(yán)重疾患。 所有研究對(duì)象均排除以下情況：(1)正在接受或曾經(jīng)接受過抗HBV治療；(2)合并感染人類免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒(HEV)；或(3)合并甲狀腺功能亢進(jìn)、糖尿病等自身免疫性疾��；或(4)合并惡性腫瘤；或(5)合并其他嚴(yán)重代謝性疾病；或(6)影像學(xué)或組織學(xué)發(fā)現(xiàn)明顯肝硬化。 縱向研究納入的研究對(duì)象來源于一項(xiàng)多中心開放性的替比夫定Ⅳ期臨床試驗(yàn)(600mg/d, CLDT600ACN07T)中的75例HBeAg陽性CHB患者,其中48例來自廣州南方醫(yī)院,27例來自新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。納入標(biāo)準(zhǔn)包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)高于正常上限(ULN), HBV DNA定量100,000copies/mL。所有研究對(duì)象于治療基線、12周、24周以及52周采集1mL血清用于細(xì)胞因子檢測(cè),南方醫(yī)院的納入對(duì)象于以上4個(gè)時(shí)間點(diǎn)留取20mL肝素抗凝血用于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。血清標(biāo)本用干冰運(yùn)輸,保存于-80℃。根據(jù)治療52周時(shí)是否發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換,以及血清HBV DNA定量300copies/mL,將研究對(duì)象分為完全應(yīng)答組(CR,n=14)和非完全應(yīng)答組(NCR, n=61).另根據(jù)治療52周HBV DNA定量是否低于300copies/mL,而不論HBeAg是否陽性,將研究對(duì)象分為病毒學(xué)應(yīng)答組(VR,n=32)和非病毒學(xué)應(yīng)答組(NVR,n=43)。 為驗(yàn)證血清IL-21濃度與治療應(yīng)答之間的關(guān)系,我們的研究在另外103例CHB患者(CR,n=42; NCR, n=61)進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證,這部分患者來源于另一項(xiàng)替比夫定抗病毒治療的臨床試驗(yàn)。分離血清保存于-80℃。 所有研究符合赫爾辛基宣言,并經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意,所有研究對(duì)象簽署知情同意書。 2.血清IL-21表達(dá)水平的測(cè)定 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)受試者血清IL-21的表達(dá)水平,包括橫向研究中119例患者,及75例HBeAg P日性CHB患者抗病毒治療基線、12周、24周及52周4個(gè)時(shí)間點(diǎn),及驗(yàn)證隊(duì)列中103例CHB患者治療基線、12周和24周共3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)。 3.外周血IL-21分泌細(xì)胞及相關(guān)表面分子的檢測(cè) 利用流式細(xì)胞內(nèi)因子染色技術(shù)檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中分泌IL-21的細(xì)胞亞群的分布情況,橫向研究比較不同慢性HBV感染者之間IL-21分泌細(xì)胞頻數(shù)的差異,以及IL-21分泌細(xì)胞與其他重要細(xì)胞亞群(如Th1、Th2、Th17及TFH細(xì)胞)之間細(xì)胞因子共表達(dá)的情況。另外,觀察CHB患者52周抗病毒治療中IL-21分泌細(xì)胞頻數(shù)的動(dòng)態(tài)變化,以及與抑制性調(diào)節(jié)因子PD-1之間的相關(guān)關(guān)系。 通過表型標(biāo)記檢測(cè)不同HBV感染者外周血中免疫細(xì)胞表達(dá)IL-21R的情況。 4.IL-21相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的表達(dá) 通過分離PBMC,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)橫向研究中76例患者IL-21R mRNA水平的表達(dá)情況,另外同時(shí)檢測(cè)17例IC與21例CHB患者IL-21相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6和ROR-γT的表達(dá)情況。 5.IL-21在體外對(duì)T、B細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的研究 通過非特異性刺激物和特異性HBcAg刺激,比較IC和CHB患者間外周血分泌IL-21的CD4+T淋巴細(xì)胞頻數(shù)差異。 利用磁珠分選技術(shù),得到CHB患者CD8+T細(xì)胞和IC患者CD8-T細(xì)胞,在HBV特異性抗原的刺激下利用Transwell板共培養(yǎng)3天,利用流式檢測(cè)CD8+T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-21R的情況。 在HBV特異性抗原及rh IL-21共刺激培養(yǎng)PBMC10天后,分別檢測(cè)IC和CHB患者PBMC培養(yǎng)上清中HBV特異性抗體的產(chǎn)生。 結(jié)果： 1.慢性HBV感染者不同狀態(tài)下IL-21的表達(dá)情況 不同慢性HBV感染者間血清IL-21水平的表達(dá)慢性HBV感染不同狀態(tài)下血清IL-21水平具有顯著性差異(p0.0001)。IC組(p=0.011)和CHB組(p0.0001)血清IL-21水平顯著性高于IT組,但兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.260)。IT組血清IL-21水平高于HC組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.265)。在ALT正常群體(IT和IC,n=41)血清IL-21水平顯著性低于ALT異常組(n=58,p=0.003)。CHB組血清IL-21水平與血清ALT水平(r=0.156,p=0.180)或HBV DNA定量(p=0.230)之間并不存在相關(guān)關(guān)系。慢性HBV感染者的年齡與血清IL-21水平呈正相關(guān)關(guān)系(p=0.006,r=0.277)。 不同慢性HBV感染者間分泌IL-21的CD4+T淋巴細(xì)胞頻數(shù)比較通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞是分泌IL-21的主要來源,CD8+T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等其他細(xì)胞也能夠分泌IL-21。佛波酯非特異性刺激6小時(shí)后,不同慢性HBV感染者PBMC中IL-21+CD4+T淋巴細(xì)胞頻數(shù)存在顯著性差異(p0.0001)。IC組IL-21+CD4+T淋巴細(xì)胞頻數(shù)顯著性高于IT組(p=0.020)和CHB組(p=0.001)。 不同慢性HBV感染者間IL-21相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的表達(dá)慢性HBV感染不同組間IL-21R mRNA水平具顯著性差異(p=0.007)。CHB組患者IL-21R mRNA水平顯著性高于IT組(p=0.006),但與IC組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.150)。IT組患者PBMC的IL-21R mRNA水平顯著性低于HC組(p=0.001)。 進(jìn)一步分析IL-21兩個(gè)重要來源細(xì)胞TFH和Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平,分別是Bcl-6和ROR-γT。CHB組ROR-γT的表達(dá)水平顯著性高于IC組(p0.0001),而IC組Bcl-6的表達(dá)水平顯著性高于CHB組(p0.0001)。 2.CHB患者52周抗病毒治療中IL-21的動(dòng)態(tài)變化 抗病毒治療52周血清HBV DNA定量、ALT水平及血清IL-21水平的變化抗病毒治療12周、24周和52周血清HBV DNA定量在CR組(n=14)和NCR組(n=61)之間有顯著性差異(p0.0002,p=0.002和p=0.002),兩組間血清ALT水平在治療24周時(shí)都降至正常值范圍內(nèi),且在各時(shí)間點(diǎn)無顯著性差異。 重復(fù)測(cè)量分析顯示血清IL-21水平隨治療時(shí)間延長(zhǎng)而下降(多因素分析和單因素分析結(jié)果分別為p=0.009和p=0.001)且CR組IL-21水平顯著性高于NCR組(p=0.004),但VR組與NVR組之間IL-21水平無顯著性差異(p=0.23)。在抗病毒治療12周,CR組血清IL-21水平顯著性高于NCR組(p=0.005),但在其他時(shí)間點(diǎn)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。盡管在治療52周時(shí)所有CHB患者血清ALT水平恢復(fù)正常,但血清IL-21濃度仍顯著性高于IT組(p=0.035)。 抗病毒治療中血清IL-21水平和HBV DNA定量對(duì)完全應(yīng)答的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證單因素分析得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)有：抗病毒治療基線、12周和24周的血清HBV DNA定量,以及治療12周血清IL-21水平。所有p0.10的指標(biāo)被納入多因素分析。構(gòu)建線性模型預(yù)測(cè)治療應(yīng)答的最佳指標(biāo)包括治療12周血清IL-21水平和治療12周HBV DNA定量(r2=0.31)。交互作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且治療12周的血清IL-21與血清HBV DNA皆為獨(dú)立影響因子(p=0.002,p=0.003)。Logistic回歸分析同樣顯示治療12周血清IL-21水平和血清HBV DNA定量為獨(dú)立影響因子(p=0.05,p=0.007)。利用治療12周血清HBV DNA定量、IL-21水平以及IL-21與HBV DNA定量的比值建立ROC曲線預(yù)測(cè)抗病毒治療52周是否產(chǎn)生完全應(yīng)答�？共《局委�12周HBV DNA定量為3.83log10copies/mL時(shí)為最佳診斷值,預(yù)測(cè)完全應(yīng)答的靈敏度和特異度分別為85.7%和70.4%�？共《局委�12周血清IL-21水平為112.3pg/mL時(shí)為最佳診斷值,預(yù)測(cè)完全應(yīng)答的靈敏度和特異度分別為73.3%和81.8%。抗病毒治療12周血清IL-21水平低于51.4pg/mL為95%HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的陰性預(yù)測(cè)值。 為驗(yàn)證血清IL-21與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換之間的關(guān)系,選取另一臨床試驗(yàn)中的103例非連續(xù)觀察患者檢測(cè)其血清IL-21水平,抗病毒治療12周CR組(n=42)血清IL-21水平顯著性高于NCR組(n=61,p=0.004),并且兩組在基線血清IL-21水平上具有顯著性差異(p=0.003)。 抗病毒治療52周患者外周血分泌IL-21的CD4+T淋巴細(xì)胞頻數(shù)的變化CR組患者IL-21+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)的平均值高于NCR組,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.080)。比較兩組在各治療時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果,抗病毒治療24周CR組的細(xì)胞頻數(shù)顯著性高于NCR組(p=0.003)。血清IL-21水平與外周血IL-21+CD4+T細(xì)胞頻數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均無相關(guān)關(guān)系。 抗病毒治療52周血清IL-21水平與PD-1之間的關(guān)系重復(fù)測(cè)量發(fā)現(xiàn)治療52周CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表達(dá)PD-1比例顯著性下降(p=0.030,p=0.210)。CR組CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表達(dá)PD-1比例更高(p=0.110,p=0.040)。在所有20例觀察對(duì)象中,治療12周時(shí)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞表達(dá)PD-1比例較基線顯著性下降(p=0.050,p=0.030)。血清IL-21水平與表達(dá)PD-1的CD8+T細(xì)胞頻數(shù)正相關(guān)(r=0.222,p=0.048)而與表達(dá)PD-1的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)無關(guān)(r=0.111,p=0.328)。 3.IL-21促進(jìn)T、B細(xì)胞應(yīng)答的體外研究 特異性抗原HBcAg刺激后,IC組能夠檢測(cè)到特異性分泌IL-21的CD4+T淋巴細(xì)胞的存在,且其頻數(shù)顯著性高于CHB組(p=0.0005)。 在HBcAg特異性刺激下,CHB患者CD8+T細(xì)胞與IC患者CD8-T細(xì)胞經(jīng)Transwell板共培養(yǎng)后,CHB患者CD8+T淋巴細(xì)胞表面IL-21R的細(xì)胞頻數(shù)比例和平均熒光密度(MFI)較培養(yǎng)前顯著升高(p=0.006),經(jīng)IL-21抗體和IL-21R抗體聯(lián)合阻斷后,CD8+T淋巴細(xì)胞表面IL-21R水平顯著下調(diào)(p=0.013)。 另外,利用HBcAg/HBeAg與IL-21共同刺激CHB或IC患者PBMC,檢測(cè)培養(yǎng)上清中HBV特異性抗體的產(chǎn)生,在20例慢性HBV感染者中有5例患者檢出anti-HBe存在,絕大多數(shù)患者可檢出anti-HBc。提示IL-21可能促進(jìn)B細(xì)胞分泌HBV特異性抗體。 結(jié)論： 慢性HBV感染橫向研究和抗病毒治療動(dòng)態(tài)觀察的結(jié)果都顯示：無論是自發(fā)的還是藥物誘導(dǎo)的HBeAg血清轉(zhuǎn)換患者血清IL-21水平以及外周血分泌IL-21的細(xì)胞頻數(shù)都顯著性升高,且抗病毒治療12周完全應(yīng)答組血清IL-21水平顯著性升高,能夠作為獨(dú)立預(yù)測(cè)1年治療發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換的重要指標(biāo),這對(duì)于抗病毒治療的早期療效預(yù)測(cè)及制定個(gè)體化治療方案都具有重要的指導(dǎo)意義。 IC患者外周血病毒特異性分泌IL-21的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)顯著升高,且在體外實(shí)驗(yàn)中能夠促進(jìn)CHB患者CD8+T細(xì)胞IL-21R表達(dá)增加,而且rhIL-21對(duì)B細(xì)胞分泌HBV特異性抗體有一定的促進(jìn)作用,提示IL-21可促進(jìn)T、B細(xì)胞HBV特異性免疫應(yīng)答,可能在未來慢性乙型病毒性肝炎的免疫治療中起重要作用。有關(guān)IL-21促進(jìn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的機(jī)制我們將進(jìn)一步的驗(yàn)證。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號(hào)：2265880