本文選題：結核分枝桿菌 + CFP-ESAT��； 參考：《中國人獸共患病學報》2015年04期

【摘要】：目的制備結核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白,探討CFP10-ESAT6融合蛋白在結核分枝桿菌免疫診斷中的應用價值。方法 PCR擴增得到CFP-10、ESAT6基因片斷,將其先后克隆入pET-28a表達載體。優(yōu)化表達條件、用鎳親和層析的方法純化帶His標簽的重組CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制備兔多克隆抗體,建立rCFP10-ESAT6為抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法,以健康者血清為對照,檢測170例結核患者血清的抗體。結果重組質(zhì)粒pET28a-CFP10-ESAT6靶基因測序結果與預計設計完全一致。融合蛋白在E.coli BL21(DE3)工程菌中均為可溶性表達,表達量占菌體總蛋白的40%。利用金屬螯合親和層析直接純化重組蛋白,純度達到95%以上。Western blot分析表明,重組蛋白能與結核患者血清發(fā)生特異性免疫結合反應,與健康者血清不發(fā)生反應。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗體的效價為1∶8 000,CFP10-ESAT6作為包被抗原的檢測結核病人血清中特異性抗體的間接ELISA最佳包被濃度為0.002μg/mL,患者血清的最佳稀釋度為1∶500。檢測結果與臨床診斷的符合率,ELISPOTELISA(rCFP10-ESAT6)ELISA(kit)。結論CFP10-ESAT6融合蛋白具有較高的抗原特異性和免疫反應性,有可能成為結核病免疫學診斷的特異抗原,對結核的診斷具有重要參考價值。
[Abstract]:Objective to prepare the CFP10-ESAT6 fusion protein of Mycobacterium tuberculosis and to explore the value of CFP10-ESAT6 fusion protein in the immunological diagnosis of Mycobacterium tuberculosis. Methods CFP-10 ESAT6 gene fragment was amplified by PCR and cloned into pET-28a expression vector. The recombinant CFP10-ESAT6 fusion protein (rCFP10-ESAT6) with his label was purified by nickel affinity chromatography. An enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) with rCFP10-ESAT6 as antigen was developed to detect antibodies in 170 tuberculosis patients. Results the sequencing results of the recombinant plasmid pET28a-CFP10-ESAT6 were in good agreement with the predicted design. The fusion protein was soluble expressed in E. coli BL21 (DE3) engineering strain and accounted for 40% of the total protein in E. coli BL21 (DE3). The recombinant protein was purified directly by metal chelate affinity chromatography. The purity of the recombinant protein was over 95%. Western blot analysis showed that the recombinant protein could react specifically with the serum of tuberculosis patients. The titer of rabbit polyclonal antibody against CFP10-ESAT6 was 1:8, 000 CFP10-ESAT6 as coating antigen. The best indirect Elisa coating concentration of specific antibody in TB patients was 0.002 渭 g / mL, and the optimal dilution of patient serum was 1: 500. The coincidence rate of the results with clinical diagnosis: ELISPOTELISA (rCFP10-ESAT6) Elisa (kit). Conclusion CFP10-ESAT6 fusion protein has high antigen-specificity and immunoreactivity, which may be a specific antigen for the immunological diagnosis of tuberculosis and has important reference value for the diagnosis of tuberculosis.
【作者單位】： 上海市公共衛(wèi)生臨床中心;
【基金】：上海市衛(wèi)生局面上基金(No.20124467) 國家自然科學基金青年基金(No.31200108) 十二五科技重大專項(No.2013ZX10004-221和2013ZX10004221-004)~~
【分類號】：R446.6;R52

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本文編號：2058436