本文選題：布魯氏菌 + MLVA-16��； 參考：《石河子大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：目的：布魯氏菌病在全球范圍內(nèi)都是一個亟待解決的難題，每年因布魯氏菌病給許多國家和地區(qū)的畜牧業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時對人類的健康形成了極大的威脅。每年報告的人患布魯氏菌病就超過50萬例。研究表明，布魯氏菌的致病能力主要依靠其在宿主中的生存和繁殖能力，并沒有公認(rèn)的一般致病細(xì)菌具有的毒力因子。布魯氏菌致病的因子主要依靠LPS、OMP和其他的毒力相關(guān)因子。OMP25是布魯氏菌的一種外膜蛋白，而omp25基因在不同種布魯氏菌之間具有高度的同源性。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）是一種在近年來有極大發(fā)展的核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用對靶基因的6個區(qū)域，設(shè)計4條引物，，在65℃恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，40-60min結(jié)束反應(yīng)，通過顏色就可方便的判定反應(yīng)結(jié)果。LAMP具有便捷和特異性高的特性，對于能夠廣泛應(yīng)用于檢測家畜間的布魯氏菌病具有十分重要的意義。 方法：首先，調(diào)查了新疆北疆地區(qū)布魯氏菌病的流行情況。從新疆烏蘇、阿勒泰、瑪納斯三個地區(qū)和西部牧業(yè)采集家畜血液樣品共1721份進(jìn)行琥紅平板和試管凝集試驗檢測，其中羊血清1053份、牛血清668份。同時對新疆上述四個地方的母畜流產(chǎn)胎兒內(nèi)容物進(jìn)行布魯氏菌病原分離、鑒定并用MLVA-16方法進(jìn)行分型鑒定。其次，為建立一種快速、高效、準(zhǔn)確診斷和檢測布魯氏菌的LAMP檢測技術(shù)的方法，針對布魯氏菌外膜蛋白基因Omp25區(qū)域設(shè)計6條引物，65℃反應(yīng)60min，85℃5min終止反應(yīng)后，用SYBR Green I染料做指示劑，根據(jù)顏色判定結(jié)果。為了評價建立的LAMP方法的特異性和敏感性，取烏蘇、阿勒泰、瑪納斯三個地區(qū)和西部牧業(yè)患病動物體內(nèi)血液分離布魯氏菌并進(jìn)行培養(yǎng)，用LAMP和PCR方法進(jìn)行平行檢測。 結(jié)果：陽性率都比較高，最高達(dá)13.8%，羊感染率平均為11.1%，牛感染率平均為4.04%。表明了布魯氏菌病在這些地區(qū)的發(fā)生率比較高。分離株用常規(guī)分型方法鑒定為羊種3型，MLVA-16方法鑒定該菌株與德國分離株Bruce0261關(guān)系最近。LAMP方法最低檢測出的靈敏度為4.2fg/μL布魯氏菌基因組DNA。本方法特異性比較好，瓊脂糖凝膠電泳檢測布魯氏菌管顯示陽性，并且都有特征性的梯形條帶，而大腸桿菌、卡介苗、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌都沒有出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象。樣品分離菌LAMP和PCR符合率100%，并且LAMP的靈敏度要高于PCR。選取的烏蘇、阿勒泰、瑪納斯三個地區(qū)和西部牧業(yè)的血樣培養(yǎng)的布魯氏菌，用LAMP和PCR檢測符合率100% 結(jié)論：（1）在新疆省內(nèi)烏蘇、阿勒泰、瑪納斯三個地區(qū)和西部牧業(yè)血清學(xué)實驗檢測結(jié)果表明這些地區(qū)的布魯氏菌病的陽性率較前些年有上升趨勢。MLVA-16實驗結(jié)果表明羊種布魯氏菌3型，基因型42型為北疆地區(qū)主要流行基因型。（2）本研究選取了布魯氏菌共有基因omp25，建立了布魯氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法，實驗表明LAMP具有高敏感性和特異性，并用LAMP方法鑒定了從新疆烏蘇、阿勒泰、瑪納斯三個地區(qū)和西部牧業(yè)采取的分離菌，和PCR結(jié)果進(jìn)行了比較，符合率較高。 該方法建立了一種快速，高效，便捷的檢測布魯氏菌的方法，為基層檢測布魯氏菌提供了一種可選的快速診斷方法。
[Abstract]:Objective: Brucellosis is an urgent problem all over the world. Every year, brucellosis has brought huge economic losses to the livestock industry in many countries and regions, and poses a great threat to human health. More than 500 thousand cases of brucellosis are reported per year. The ability of the disease mainly depends on its survival and reproductive capacity in the host, and there is no universally recognized virulence factor of the general pathogenic bacteria. The factors causing the disease of Brucella are mainly dependent on LPS, OMP and other virulence related factors.OMP25 are a kind of outer membrane protein of Brucella, and the omp25 base has a high level between different Brucella species. Homology. Ring mediated isothermal amplification (LAMP) is a kind of nucleic acid amplification technology which has been greatly developed in recent years. Using 6 regions of target gene, 4 primers are designed, amplification at the constant temperature of 65, 40-60min end reaction, and the convenient and specific characteristic of.LAMP, which can be conveniently determined by color. It is very useful for detecting brucellosis among livestock.
Methods: first, the epidemic situation of brucellosis in northern Xinjiang area was investigated. A total of 1721 blood samples collected from three regions of Xinjiang, Aletai, Manasi and Western pastoral areas were tested for succinic red plate and test tube agglutination test, including 1053 sheep sera and 668 bovine blood albumin. At the same time, there were four local animals in Xinjiang. The abortion fetal contents were separated, identified and identified by MLVA-16 method. Secondly, a rapid, efficient, accurate diagnosis and detection method of Brucella LAMP was established. 6 primers were set for the Omp25 region of the outer membrane protein gene of Brucella, 65 C reaction 60min, and 85 centigrade 5min after the termination of the reaction. In order to evaluate the specificity and sensitivity of the established LAMP method, SYBR Green I dyestuff was used as an indicator to determine the specificity and sensitivity of the established LAMP method. The blood separation of Brucella from three regions of Wusu, Aletai, Manasi and Western Pastoral animals was isolated and cultured, and the LAMP and PCR methods were used to carry out parallel detection.
Results: the positive rate was high, the highest was 13.8%, the average rate of sheep infection was 11.1%, the average rate of cattle infection was 4.04%., which showed that the incidence of brucellosis was higher in these areas. The isolated strain was identified as the sheep species 3 by the conventional typing method, and the MLVA-16 method identified the relationship between the strain and the German isolate Bruce0261 recently by the.LAMP method. The sensitivity of the method was 4.2fg/ mu L Brucella genomic DNA., the specificity of this method was better. Agarose gel electrophoresis detected brucellosis tube positive, and there were characteristic trapezoid bands, while Escherichia coli, Bacillus Calmette vaccine, Staphylococcus aureus and Listeria had no amplification phenomenon. The coincidence rate of sample isolates LAMP and PCR was 10 0%, and the sensitivity of LAMP is higher than that of Wusu, which is selected by PCR., Aletai, three regions of Manasi and the blood samples from the western animal husbandry, and the coincidence rate of LAMP and PCR is 100%.
Conclusions: (1) the test results of the serological tests in three regions and western regions of Xinjiang province in Xinjiang province showed that the positive rate of brucellosis in these areas was higher than that of the previous years. The results of the.MLVA-16 experiment showed that the sheep Brucella type 3 and genotype 42 were the main genotypes in Northern Xinjiang. (2) the study was selected. The common gene omp25 of Brucella was taken, and the method of isothermal amplification of Brucella was established. The experiment showed that LAMP had Gao Min sensibility and specificity, and the isolated bacteria from three regions of Wusu, Aletai, Manasi, Xinjiang and Western pasture were identified by LAMP method. The results were compared with the results of PCR, and the coincidence rate was high.
This method has established a fast, efficient and convenient method for Brucella detection, providing an alternative rapid diagnostic method for Brucella.
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R516.7

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本文編號：2029506