本文選題：異尖線蟲 + Ⅲ期幼蟲��； 參考：《中國疾病預防控制中心》2013年碩士論文

【摘要】：異尖線蟲病是一種因食用生的或未煮熟的含異尖線蟲Ⅲ期幼蟲的海魚而引起的消化系統(tǒng)食源性寄生蟲病。主要致病的蟲種為簡單異尖線蟲(Anisakis simplex)和派氏異尖線蟲(Anisakis pegreffii)。該病呈世界性分布,主要引起胃異尖線蟲病、腸異尖線蟲病和胃腸外異尖線蟲病。我國對黃海、渤海、北海等海域及沿海城市的海魚調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)了異尖線蟲。目前確診異尖線蟲病仍以纖維內(nèi)窺鏡檢查發(fā)現(xiàn)蟲體為依據(jù),而對臨床上惡心、嘔吐、上腹部疼痛等不典型的異尖線蟲病癥狀的確診存在困難。雖然免疫學、分子生物學技術(shù)已應用于異尖線蟲病的輔助診斷及鑒定,但仍缺乏有效的診斷試劑和快速診斷方法。因此,本研究欲以異尖線蟲Ⅲ期幼蟲為材料,通過提取異尖線蟲Ⅲ期幼蟲粗抗原建立ELISA法和Western Blot,以及制作異尖線蟲Ⅲ期幼蟲免疫層析試紙條,并構(gòu)建異尖線蟲Ⅲ期幼蟲cDNA文庫,以期獲得高效、快速的免疫診斷方法及獲得有價值的診斷抗原。 本研究以東海海域帶魚為研究材料,人工剖檢帶魚,在帶魚體腔、腸系膜、肝臟等處尋找異尖線蟲Ⅲ期幼蟲,并進行形態(tài)學觀察及分子鑒定。在此之后對異尖線蟲Ⅲ期幼蟲,以勻漿凍融及超聲法制備Ⅲ期幼蟲可溶性抗原(soluble antigens of third-stage larvae of anisakis, SAA),進行ELISA和Western Blot用于檢測與其他寄生蟲病人血清是否存在交叉反應。同時建立一種檢測異尖線蟲病的免疫層析試紙條,并對其進行測試。最后構(gòu)建異尖線蟲Ⅲ期幼蟲cDNA文庫,并對此文庫進行評價。 結(jié)果,共解剖購自東海海域的帶魚132條,收集異尖線蟲幼蟲1695條,平均每條帶魚體內(nèi)都有10條以上的異尖線蟲Ⅲ期幼蟲,感染率為100%。蟲體平均長度20-30mmm,頭部有特征性的乳突、鉆齒尾部有小棘,身體呈波浪形蠕動。經(jīng)BLAST比對,與已提交到Genbank的派氏異尖線蟲(JQ900763.1)的序列相似性達99%。 以制備的異尖線蟲Ⅲ期幼蟲可溶性抗原(SAA)進行ELISA試驗,檢測異尖線蟲感染鼠血清,敏感性100%,特異性100%。與肝吸蟲病人和囊蟲病人血清各有10%的交叉反應,與血吸蟲病、旋毛蟲病、蛔蟲病、鉤蟲病、弓形蟲病、舌形蟲病等病人血清未見交叉反應。以SDS-PAGE技術(shù)對SAA抗原作進一步分析,獲得兩條分子量為38、55kDa的主蛋白帶和分子量界于10～70kDa之間的10條次帶。經(jīng)Western blot分析,能被感染大鼠血清識別的條帶中,Mr170、130、73、38、22、15kDa等條帶反應較強。與血吸蟲病、肝吸蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病、蛔蟲病、鉤蟲病、弓形蟲病、舌形蟲病病人及正常人血清無交叉反應條帶,而與肺吸蟲、鞭蟲病人血清分別在Mr70kDa和Mr93kDa處有交叉反應條帶出現(xiàn)。 以制備的異尖線蟲Ⅲ期幼蟲可溶性抗原(SAA)點膜,制備膠體金免疫層析試紙條。檢測異尖線蟲免疫兔血清3份,感染大鼠血清10份,均顯示陽性,敏感性為100%,特異性為100%。共檢測其他寄生蟲病人血清161份,其中18份肝吸蟲病人血清中有1份顯示為陽性,同肝吸蟲病人血清的交叉反應率5.6%(1/18),與其它寄生蟲病人血清未見交叉反應。 采用SMART技術(shù),即利用毫微克的RNA或mRNA獲得高質(zhì)量和全長的cDNA文庫,可以保存全部mRNA5'末端的序列,且λ TriplEx2載體具有高低定量,重組藍白斑檢測,調(diào)節(jié)克隆插入片段的表達等優(yōu)點。成功構(gòu)建異尖線蟲Ⅲ期幼蟲的cDNA文庫。噬菌體文庫滴度為2.92×106pfu/ml。經(jīng)藍白斑篩選,重組率為95.7%。隨機挑選29個噬菌斑進行PCR,看平均片段長度。結(jié)果顯示插入率為97.9%,最大片段長度為2000bp,最小片段長度為400bp,平均片段長度為850bp。 綜上所述,本研究以異尖線蟲Ⅲ期幼蟲為研究對象,對其進行分子鑒定后,確認為簡單異尖線蟲姐妹種---派氏異尖線蟲。建立的ELISA方法、Western Blot方法對于異尖線蟲病有較好的免疫診斷效果。成功制作了一種檢測異尖線蟲病的膠體金免疫層析試紙條,此試紙條敏感性高,特異性好,交叉反應少,且制作簡便,可做為異尖線蟲病的快速檢測試紙條。最后成功構(gòu)建了異尖線蟲Ⅲ期幼蟲的全長cDNA文庫,為后續(xù)進行基因功能研究,篩選免疫診斷重組抗原奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aisakis simplex ( Anisakis simplex ) and Anisakis similis ( Anisakis simplex ) . In order to obtain high efficiency , rapid immunological diagnosis and to obtain valuable diagnostic antigens , this study has been applied to the diagnosis and identification of isotip nematode 鈪，

本文編號：2026208