發(fā)布時(shí)間：2018-06-16 09:32

  本文選題：異尖線蟲(chóng) + Ⅲ期幼蟲(chóng)��； 參考：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2013年碩士論文

【摘要】：異尖線蟲(chóng)病是一種因食用生的或未煮熟的含異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)的海魚(yú)而引起的消化系統(tǒng)食源性寄生蟲(chóng)病。主要致病的蟲(chóng)種為簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)(Anisakis simplex)和派氏異尖線蟲(chóng)(Anisakis pegreffii)。該病呈世界性分布,主要引起胃異尖線蟲(chóng)病、腸異尖線蟲(chóng)病和胃腸外異尖線蟲(chóng)病。我國(guó)對(duì)黃海、渤海、北海等海域及沿海城市的海魚(yú)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)了異尖線蟲(chóng)。目前確診異尖線蟲(chóng)病仍以纖維內(nèi)窺鏡檢查發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體為依據(jù),而對(duì)臨床上惡心、嘔吐、上腹部疼痛等不典型的異尖線蟲(chóng)病癥狀的確診存在困難。雖然免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于異尖線蟲(chóng)病的輔助診斷及鑒定,但仍缺乏有效的診斷試劑和快速診斷方法。因此,本研究欲以異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)為材料,通過(guò)提取異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)粗抗原建立ELISA法和Western Blot,以及制作異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)免疫層析試紙條,并構(gòu)建異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù),以期獲得高效、快速的免疫診斷方法及獲得有價(jià)值的診斷抗原。 本研究以東海海域帶魚(yú)為研究材料,人工剖檢帶魚(yú),在帶魚(yú)體腔、腸系膜、肝臟等處尋找異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng),并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定。在此之后對(duì)異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng),以勻漿凍融及超聲法制備Ⅲ期幼蟲(chóng)可溶性抗原(soluble antigens of third-stage larvae of anisakis, SAA),進(jìn)行ELISA和Western Blot用于檢測(cè)與其他寄生蟲(chóng)病人血清是否存在交叉反應(yīng)。同時(shí)建立一種檢測(cè)異尖線蟲(chóng)病的免疫層析試紙條,并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。最后構(gòu)建異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)cDNA文庫(kù),并對(duì)此文庫(kù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果,共解剖購(gòu)自東海海域的帶魚(yú)132條,收集異尖線蟲(chóng)幼蟲(chóng)1695條,平均每條帶魚(yú)體內(nèi)都有10條以上的異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng),感染率為100%。蟲(chóng)體平均長(zhǎng)度20-30mmm,頭部有特征性的乳突、鉆齒尾部有小棘,身體呈波浪形蠕動(dòng)。經(jīng)BLAST比對(duì),與已提交到Genbank的派氏異尖線蟲(chóng)(JQ900763.1)的序列相似性達(dá)99%。 以制備的異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)可溶性抗原(SAA)進(jìn)行ELISA試驗(yàn),檢測(cè)異尖線蟲(chóng)感染鼠血清,敏感性100%,特異性100%。與肝吸蟲(chóng)病人和囊蟲(chóng)病人血清各有10%的交叉反應(yīng),與血吸蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、鉤蟲(chóng)病、弓形蟲(chóng)病、舌形蟲(chóng)病等病人血清未見(jiàn)交叉反應(yīng)。以SDS-PAGE技術(shù)對(duì)SAA抗原作進(jìn)一步分析,獲得兩條分子量為38、55kDa的主蛋白帶和分子量界于10～70kDa之間的10條次帶。經(jīng)Western blot分析,能被感染大鼠血清識(shí)別的條帶中,Mr170、130、73、38、22、15kDa等條帶反應(yīng)較強(qiáng)。與血吸蟲(chóng)病、肝吸蟲(chóng)病、囊蟲(chóng)病、旋毛蟲(chóng)病、蛔蟲(chóng)病、鉤蟲(chóng)病、弓形蟲(chóng)病、舌形蟲(chóng)病病人及正常人血清無(wú)交叉反應(yīng)條帶,而與肺吸蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)病人血清分別在Mr70kDa和Mr93kDa處有交叉反應(yīng)條帶出現(xiàn)。 以制備的異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)可溶性抗原(SAA)點(diǎn)膜,制備膠體金免疫層析試紙條。檢測(cè)異尖線蟲(chóng)免疫兔血清3份,感染大鼠血清10份,均顯示陽(yáng)性,敏感性為100%,特異性為100%。共檢測(cè)其他寄生蟲(chóng)病人血清161份,其中18份肝吸蟲(chóng)病人血清中有1份顯示為陽(yáng)性,同肝吸蟲(chóng)病人血清的交叉反應(yīng)率5.6%(1/18),與其它寄生蟲(chóng)病人血清未見(jiàn)交叉反應(yīng)。 采用SMART技術(shù),即利用毫微克的RNA或mRNA獲得高質(zhì)量和全長(zhǎng)的cDNA文庫(kù),可以保存全部mRNA5'末端的序列,且λ TriplEx2載體具有高低定量,重組藍(lán)白斑檢測(cè),調(diào)節(jié)克隆插入片段的表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。成功構(gòu)建異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)。噬菌體文庫(kù)滴度為2.92×106pfu/ml。經(jīng)藍(lán)白斑篩選,重組率為95.7%。隨機(jī)挑選29個(gè)噬菌斑進(jìn)行PCR,看平均片段長(zhǎng)度。結(jié)果顯示插入率為97.9%,最大片段長(zhǎng)度為2000bp,最小片段長(zhǎng)度為400bp,平均片段長(zhǎng)度為850bp。 綜上所述,本研究以異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行分子鑒定后,確認(rèn)為簡(jiǎn)單異尖線蟲(chóng)姐妹種---派氏異尖線蟲(chóng)。建立的ELISA方法、Western Blot方法對(duì)于異尖線蟲(chóng)病有較好的免疫診斷效果。成功制作了一種檢測(cè)異尖線蟲(chóng)病的膠體金免疫層析試紙條,此試紙條敏感性高,特異性好,交叉反應(yīng)少,且制作簡(jiǎn)便,可做為異尖線蟲(chóng)病的快速檢測(cè)試紙條。最后成功構(gòu)建了異尖線蟲(chóng)Ⅲ期幼蟲(chóng)的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù),為后續(xù)進(jìn)行基因功能研究,篩選免疫診斷重組抗原奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
[Abstract]:Aisakis simplex ( Anisakis simplex ) and Anisakis similis ( Anisakis simplex ) . In order to obtain high efficiency , rapid immunological diagnosis and to obtain valuable diagnostic antigens , this study has been applied to the diagnosis and identification of isotip nematode 鈪，

本文編號(hào)：2026208