本文選題：新生隱球菌 + 膜聯(lián)蛋白A2��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文

【摘要】：【研究目的】新生隱球菌是臨床機會性致病真菌,能夠突破宿主血腦屏障而感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起高致死率的隱球菌腦膜腦炎;隱球菌經(jīng)呼吸道感染,首先定植于肺部,因此宿主肺部免疫反應強弱一定程度上決定隱球菌是否能夠在體內(nèi)增殖及擴散入血而造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)播散。本研究擬以隱球菌的致病機制為中心,主要圍繞上述隱球菌感染機體過程中的兩大問題,即隱球菌如何突破宿主血腦屏障、宿主針對隱球菌感染的肺部免疫反應的調(diào)節(jié)展開:第一部分主要探究宿主膜聯(lián)蛋白家族中最重要的鈣調(diào)節(jié)蛋白-膜聯(lián)蛋白A2(Annexin A2,Anx A2)在隱球菌突破血腦屏障過程中的調(diào)節(jié)作用及其分子機制,旨在揭示隱球菌與宿主腦微血管內(nèi)皮細胞相互作用過程中調(diào)節(jié)骨架蛋白重構(gòu)相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導通路;第二、三部分主要研究構(gòu)建表達宿主源性腫瘤壞死因子TNF?的轉(zhuǎn)基因隱球菌菌株及通過該菌株誘導宿主產(chǎn)生保護性免疫反應的可行性,旨在探究感染灶局部應用TNF?的對隱球菌免疫調(diào)節(jié)效應,探索外源性細胞因子輔助治療隱球菌感染的新途徑�！狙芯糠椒ā康谝徊糠忠泽w外血腦屏障模型、隱球菌-內(nèi)皮細胞粘附模型為基礎,通過慢病毒轉(zhuǎn)染shRNA下調(diào)表達Anx A2蛋白,以探究其在隱球菌與內(nèi)皮細胞粘附、穿越血腦屏障模型過程中的作用;通過探究Anx A2主要磷酸化位點磷酸化狀態(tài)、構(gòu)建去磷酸化細胞系、應用特異性抑制劑等,明確其與下游骨架調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)系。第二部分通過PCR構(gòu)建鼠源TNF?表達元件,以標準株H99為背景,借助基因槍轉(zhuǎn)化系統(tǒng)構(gòu)建表達鼠源性TNF?的新生隱球菌菌株,通過抗生素篩選、表型驗證、細胞因子表達檢測等獲得能夠穩(wěn)定表達鼠源性TNFa的隱球菌菌株。第三部分以隱球菌吸入感染小鼠模型為基礎,通過比較感染表達TNF?的轉(zhuǎn)基因菌株與標準株后小鼠生存時間、不同感染時間點各臟器菌落負荷及肺組織病理等判斷表達TNF?的轉(zhuǎn)基因菌株是否具有保護作用;分離感染后小鼠肺組織白細胞,以特異性抗體標記白細胞表面抗原,應用流式細胞儀分析比較不同菌株感染后不同時間點白細胞類群和細胞數(shù)目變化;檢測細胞培養(yǎng)上清中細胞因子表達譜遍化、巨噬細胞激活模式變化,明確表達TNF?的轉(zhuǎn)基因菌株感染后對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用�！窘Y(jié)果】第一部分利用小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系構(gòu)建的體外血腦屏障模型符合研究要求;隱球菌刺激腦微血管內(nèi)皮細胞引起AnxA2蛋白表達上調(diào)并改變其空間分布;封閉細胞膜外表面AnxA2后新生隱球菌穿越血腦屏障效率顯著下降;下調(diào)內(nèi)皮細胞AnxA2蛋白表達導致隱球菌與內(nèi)皮細胞粘附率增加但不影響其穿越體外血腦屏障的整體效率;AnxA2缺失導致S100A10降解,進而引起隱球菌穿越血腦屏障效率下降;AnxA2 N末端23位酪氨酸(Tyr23)磷酸化調(diào)控下游Cofilin蛋白磷酸化而調(diào)節(jié)隱球菌穿越血腦屏障。第二部分通過基因槍轉(zhuǎn)化獲得的陽性克隆子具有TNF?表達序列;編號為T16的陽性克隆菌株在體外培養(yǎng)基體內(nèi)環(huán)境條件下均能穩(wěn)定表達、分泌TNFa且該菌株與標準株H99相比,無明顯生長缺陷和毒力因子缺陷。第三部分T16菌株感染小鼠較野生株感染組生存時間明顯延長、肺部菌荷量明顯下降。肺部病理切片顯示,T16菌株感染小鼠肺部隱球菌感染灶較野生株感染組病灶更為局限并由局部浸潤的大量免疫細胞包裹。在固有免疫階段,T16菌株分泌的TNF?促進宿主巨噬細胞通過經(jīng)典激活方式激活(M1)提高了巨噬細胞殺菌能力;在適應性免疫階段,免疫細胞類群比例分析顯示T16菌株感染組小鼠肺部以誘導保護性T細胞浸潤為主,非保護性嗜酸粒細胞浸潤減少。同時,肺部非保護性Th2型細胞因子表達減少。T16菌株產(chǎn)生的TNF?誘導宿主肺組織中樹突狀細胞CD103+亞群和單核細胞成熟分化,是T16菌株誘導機體產(chǎn)生保護性適應性免疫應答的重要機制。【結(jié)論】第一部分宿主膜聯(lián)蛋白AnxA2蛋白在隱球菌穿越血腦屏障的過程中發(fā)揮多重調(diào)節(jié)作用:一方面通過去磷酸化引起下游骨架調(diào)節(jié)蛋白激活,促進隱球菌與腦微血管內(nèi)皮細胞粘附;另一方面,隱球菌穿越血腦屏障過程依賴AnxA2的伴侶蛋白S100A10,而AnxA2在該過程中發(fā)揮穩(wěn)定S100A10的作用,從而間接調(diào)節(jié)隱球菌穿越血腦屏障的過程。第二、三部分表達鼠源性TNF?的新生隱球菌菌株T16分泌的TNF?在小鼠感染模型中能夠誘導機體產(chǎn)生一定的保護性免疫應答,包括固有免疫階段增強巨噬細胞殺菌能力,在適應性免疫階段誘導免疫反應向保護性的I型免疫反應極化,為臨床應用細胞因子輔助治療隱球菌感染提供了新的思路。
[Abstract]:[Objective] Cryptococcus neoformans is a clinical opportunistic pathogenic fungus, which can break through the blood brain barrier of the host and infect the high lethal rate of Cryptococcus meningoencephalitis in the central nervous system. Cryptococcus neoformans is infected by respiratory tract and is first fixed in the lungs. Therefore, the strong weak immune response of the host lung determines whether Cryptococcus can be in body to some extent. This study intends to focus on the pathogenesis of Cryptococcus neoformans, focusing mainly on the two major problems in the process of cryptococcus infection, namely, how Cryptococcus breaks through the host blood brain barrier and the host's regulation of the immune response to cryptococcus infection: the first part of the study The most important calcium regulatory protein A2 (Annexin A2, Anx A2) in the host membrane protein family is to regulate the regulation and molecular mechanism of Cryptococcus neoformans in the process of breaking through the blood brain barrier. The aim is to reveal the signal transduction pathway related to the remodeling of the skeleton protein during the interaction of Cryptococcus neoformans and the host brain microvascular endothelial cells; second, The three part mainly studies the construction of transgenic Cryptococcus neoformans expressing the host derived tumor necrosis factor TNF and the feasibility of inducing protective immune response by this strain. The aim of this study is to explore the immunoregulation effect of TNF? On Cryptococcus neoformans and explore the new way of exogenous cytokines to treat cryptococcus infection. [method] [method] the first part is based on an in vitro blood brain barrier model, cryptococcal endothelial cell adhesion model, and down regulation of Anx A2 protein by lentivirus transfection to shRNA in order to explore its role in Cryptococcus neoformans adhesion to endothelial cells and through the process of crossing the blood brain barrier model, by exploring the phosphorylation of the main phosphorylation sites of Anx A2. State, constructing dephosphorylated cell lines, using specific inhibitors, and so on, to clarify the relationship with the downstream cytoskeleton regulation proteins. Second part of the mouse source TNF? Expression element was constructed by PCR, and the standard strain H99 was used as the background to construct a new Cryptococcus neoformans expressing mouse derived TNF with the aid of the gene gun transformation system. In the third part, the third part is based on the mouse model of Cryptococcus inhalation infection, and the expression of TNF by comparing the survival time of the transgenic strains expressing TNF with the standard strain, the drop load of the organs and the lung histopathology at different time points of the infection. Whether the transgenic strain has protective effect, the leukocyte in the lung tissue of the mice after infection is separated, the leukocyte surface antigen is marked with specific antibody, and the changes of the leucocyte group and the number of cells at different time points after the infection are analyzed by flow cytometry. The activation pattern changes clearly to express the regulatory effect of TNF? Transgenic strains infected with the host immune system. [results] the first part of the mouse brain microvascular endothelial cell line constructed in vitro blood brain barrier model conforms to the research requirements; Cryptococcus neoformans stimulates the brain microvascular endothelial cells to increase the expression of AnxA2 protein and change its empty space. The efficiency of Cryptococcus neoformans traversing the blood brain barrier after AnxA2 closed cell surface was significantly decreased, and the expression of AnxA2 protein in endothelial cells decreased the overall efficiency of Cryptococcus neoformans and endothelial cells, but did not affect the overall efficiency of the blood brain barrier across the body, and the AnxA2 deletion led to the degradation of S100A10, which could lead to Cryptococcus neoformans crossing the blood brain barrier. The efficiency of AnxA2 N terminal 23 tyrosine (Tyr23) phosphorylation regulates the phosphorylation of the downstream Cofilin protein to regulate Cryptococcus neoformans through the blood brain barrier. The positive clones obtained through the transformation of the second part of the gene gun have TNF? Expression sequence; the positive clones numbered as T16 can be expressed stably under the environment conditions of the culture medium in vitro. There was no obvious growth defect and virulence factor deficiency compared with the standard strain H99. The survival time of the third T16 strains infected mice was significantly longer than that of the wild strain infected mice, and the pulmonary bacteria charge decreased significantly. The lung pathological sections showed that the lung cryptococcus infection foci in the lungs of the T16 strain infected mice were more than those of the wild strain infected group. Localized and localized infiltration of immune cells. In the innate immune phase, the TNF secreted by T16 strain promotes macrophage bactericidal ability through classical activation (M1). In the adaptive immunization stage, the immune cell group ratio analysis shows that the T16 strain infected mice lung to induce protective T. Cell infiltration and non protective eosinophil infiltration decrease. Meanwhile, the expression of non protective Th2 type cytokines in the lung reduces the TNF produced by.T16 strain, and induces the maturation and differentiation of dendritic cells CD103+ subsets and monocytes in the host lung tissue, which is an important mechanism for the T16 strain to induce the protective adaptive immune response in the body. In part 1, the first part of the host membrane protein AnxA2 protein plays multiple regulatory roles in the process of Cryptococcus neoformans through the blood brain barrier: on one hand, the activation of the downstream cytoskeleton through dephosphorylation and the adhesion of Cryptococcus neoformans to the cerebral microvascular endothelial cells; on the other hand, Cryptococcus neoformans through the blood brain barrier depend on the chaperone protein of the AnxA2 S100A10, and AnxA2 plays the role of stabilizing S100A10 in this process, which indirectly regulates the process of Cryptococcus neoformans crossing the blood brain barrier. The second, third part expresses TNF secreted by Cryptococcus neoformans strain T16 of mouse derived TNF? In the mouse infection model, it can induce a certain protective immune response in the mouse infection model, including the enhancement of the inherent immune phase. The bactericidal ability of macrophages, inducing immune response to protective I type immunoreaction during adaptive immunization stage, provides a new idea for the clinical application of cytokines to treat cryptococcus infection.
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R519.4

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本文編號：1980760