本文選題：蛋白酶體輔助因子 + 分枝桿菌��； 參考：《西南大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,簡稱結(jié)核菌)引起的全球性感染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,全球三分之一的人感染過結(jié)核菌,而僅在2012年結(jié)核病患者就有860萬,全球結(jié)核病死亡人數(shù)高達(dá)130萬。結(jié)核病疫情如此嚴(yán)重,除了其致病菌結(jié)核菌的獨(dú)特致病特性外,多重耐藥結(jié)核(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB)的出現(xiàn)以及和結(jié)核菌與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)共感染,使得結(jié)核病疫情更加難以控制。 目前治療結(jié)核病的一線藥物包括異煙肼(Isoniazid, INH).利福平(Rifampicin, RIF)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide, PZA)以及乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)對MDR-TB和XDR-TB患者無效。因此二線抗結(jié)核藥物氨基糖苷類抗生素、多肽類抗生素和氟喹諾酮類抗生素作為MDR-TB和XDR-TB患者的主要藥物。其中氟喹諾酮藥物因具備低毒副作用和大量的衍生物的特點(diǎn)而倍受重視。然而,針對氟喹諾酮藥物的耐藥菌的不斷出現(xiàn)使得結(jié)核病防控雪上加霜。 因此,我們試圖尋找分枝桿菌耐氟喹諾酮藥物的新機(jī)制,將相關(guān)基因作為潛在的氟喹諾酮藥物增效劑靶點(diǎn),為解決MDR-TB和XDR-TB的藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)之前的工作初篩到了一株對莫西沙星超敏感的恥垢分枝桿菌(Mycobacteirum smegmatis)突變株M371,并鑒定了轉(zhuǎn)座子插入的位點(diǎn)。本課題將進(jìn)一步驗(yàn)證突變株M371超敏感的表型及其機(jī)制,并初步探索突變株在脅迫反應(yīng)中的作用。 首先,采用8倍野生型恥垢分枝桿菌最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)的莫西沙星處理恥垢分枝桿菌野生型和突變株M371,記錄處理不同時(shí)間后的菌落形成單位(colony-forming unit,CFU),計(jì)算存活率并作殺菌曲線,驗(yàn)證突變株M371的莫西沙星超敏感表型。然后,為了研究基因MSMEG_3888在恥垢分枝桿菌在天然耐受(intrinsic resistance)莫西沙星中的作用,構(gòu)建突變株M371的回補(bǔ)菌株。而MSMEG_3888結(jié)核菌H37Rv中的對應(yīng)基因?yàn)镽v2095c。將基因Rv2095c克隆并連接到穿梭質(zhì)粒pALACE上,并將重組質(zhì)粒pALACE-Rv2095c電轉(zhuǎn)化入突變株M371,獲得回補(bǔ)菌株。并采用Western-blot檢測回補(bǔ)菌株中基因Rv2095c的表達(dá)和MIC實(shí)驗(yàn)判斷對莫西沙星的敏感性。最后,探索突變株M371、野生株和回補(bǔ)菌株在表面性質(zhì)方面的差異,并以過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)及十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfonate, SDS)模擬肺泡的環(huán)境來研究三株菌的脅迫反應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：恥垢分枝桿菌突變株M371的經(jīng)莫西沙星處理存活率比野生型低,為莫西沙星超敏感表型。通過菌液PCR驗(yàn)證和基因測序,證明了成功構(gòu)建了回補(bǔ)菌株M371-pALACE-Rv2095c。Western-blot驗(yàn)證了Rv2095c異源表達(dá)成功,并且回補(bǔ)菌株與野生型具有相同的耐受能力。由此證明了基因MSMEG_3888參與對莫西沙星的本底耐受。在生物表面性質(zhì)方面,恥垢分枝桿菌野生型、突變株M371和回補(bǔ)菌株,三者在單菌落形態(tài)和滑動(dòng)能力方面無明顯差異；但在脂質(zhì)系數(shù)方面差異明顯,突變株較野生型明顯下降。三者在SDS耐受水平無顯著差異,突變株較野生株在雙氧水耐受水平亦無明顯差異。三株菌在脅迫應(yīng)答中無明顯差異。 因此,本研究證明了基因MSMEG_3888的參與天然耐受,基因MSMEG_3888并不影響恥垢分枝桿菌的表面性質(zhì),亦不參與脅迫應(yīng)答。
[Abstract]:Tuberculosis is a global infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis . According to the World Health Organization , one - third of the world ' s people have been infected with tuberculosis , but only in 2012 there were 8.6 million TB patients . The number of tuberculosis deaths in the world was 1.3 million . The presence of multi - drug resistant tuberculosis ( MDR - TB ) and broad - resistant tuberculosis ( XDR - TB ) , and tuberculosis and human immunodeficiency virus ( HIV ) , were more difficult to control , in addition to their unique pathogenic characteristics .

Currently , first - line drugs for tuberculosis include Isophthalazide ( INH ) . Rifampicin , rif , pyrazinamide ( PZA ) and ethambutol ( emb ) are ineffective for MDR - TB and XDR - TB patients . Therefore , two - line anti - tuberculosis drugs , such as aminoglycosides , polypeptide antibiotics and fluoroquinolone antibiotics , are important drugs for MDR - TB and XDR - TB patients .

Therefore , we try to find a new mechanism of fluoroquinolone drug for Mycobacterium tuberculosis , which will provide the basis for the drug development of MDR - TB and XDR - TB .

The mutant M371 was cloned and ligated into the shuttle plasmid pALACE . The results showed that the mutation strain M371 was cloned and ligated into the shuttle plasmid pALACE , and then the recombinant plasmid pALACE - Rv95c was transformed into the shuttle plasmid pALACE .

The results showed that the survival rate of M371 of Mycobacterium smegmatis mutant strain M371 was lower than that of wild type , which was more sensitive than wild type .
However , there was no significant difference between mutant strain and wild - type strain at SDS - tolerance level . There was no significant difference in the tolerance level between mutant strain and wild strain . There was no significant difference in the stress response .

Therefore , the study demonstrated that the gene MSV3888 was not involved in the surface properties of Mycobacterium smegmatis , nor was it involved in the stress response .
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R52

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5 張s，

本文編號：1967032