本文選題：細(xì)粒棘球絳蟲(chóng) + 原頭節(jié)��； 參考：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2014年博士論文

【摘要】：包蟲(chóng)病,是由棘球蚴寄生于人體及多種動(dòng)物體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)疾病。該病嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展,目前已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。在我國(guó)以細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcus granulosus, E. granulosus)感染引起的囊性包蟲(chóng)病為主,至今仍未得到有效控制。對(duì)蟲(chóng)體免疫逃避機(jī)制以及生理適應(yīng)性認(rèn)識(shí)不足制約了細(xì)粒棘球蚴疫苗及藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)階段即原頭節(jié),不僅能夠在終末宿主的小腸中發(fā)育成成蟲(chóng),而且可以在中間宿主體內(nèi)發(fā)育成單室性包囊(即“雙向發(fā)育”能力)。此外,它能夠感染、適應(yīng)多種哺乳動(dòng)物宿主。這些特點(diǎn)讓原頭節(jié)成為寄生蟲(chóng)-宿主相互作用研究的重要模型。本課題從宿主-病原相互作用關(guān)系入手,探索細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)感染對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的作用,尤其關(guān)注免疫細(xì)胞前體細(xì)胞——髓源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)在感染前后差異表達(dá)基因?qū)ζ涔δ艿恼{(diào)控；同時(shí)利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及生物信息學(xué)技術(shù),分析原頭節(jié)排泄分泌蛋白整體功能特征。研究結(jié)果將深化細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)免疫逃避機(jī)制及其生理適應(yīng)性認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步開(kāi)展包蟲(chóng)病新型疫苗的設(shè)計(jì)及優(yōu)化、藥物靶標(biāo)的篩選提供重要分子基礎(chǔ)。第一部分細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)感染小鼠免疫細(xì)胞表型及功能宿主免疫系統(tǒng)的功能、狀態(tài)是宿主抵抗寄生蟲(chóng)的關(guān)鍵,而免疫逃避是寄生蟲(chóng)在宿主體內(nèi)生存的必要條件。前人研究表明E. granulosus原頭節(jié)感染可顯著下調(diào)或抑制宿主免疫應(yīng)答,是其免疫逃避的重要因素,但究竟是怎樣的調(diào)節(jié)機(jī)制至今尚不明確。本研究從整體水平研究E. granulosus原頭節(jié)感染對(duì)宿主執(zhí)行固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞功能的影響,探索其可能的免疫逃避機(jī)制。從病羊肝臟(或肺臟)包囊中收集原頭節(jié),分子鑒定為G1型,腹腔注射感染Balb/c小鼠,2000條/只,建立細(xì)粒棘球蚴病小鼠模型。同時(shí)設(shè)立生理鹽水對(duì)照組。在感染后不同時(shí)間點(diǎn)(30,180,360 d)采集小鼠外周血和脾臟,制備單細(xì)胞懸液。通過(guò)多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟和外周血中各種免疫細(xì)胞的表型特點(diǎn)及比例,并結(jié)合功能實(shí)驗(yàn),探索原頭節(jié)感染對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果,在感染后30天,表達(dá)CD11b、CD11c分子的細(xì)胞(即抗原遞呈細(xì)胞)比例增加,但其MHC-Ⅱ分子表達(dá)輕微下調(diào)。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,感染組小鼠固有免疫細(xì)胞如抗原遞呈細(xì)胞、GR-1+粒細(xì)胞比例均明顯增加,值得注意的是,共表達(dá)CD11b+/Gr-1+標(biāo)志的髓源抑制性細(xì)胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)比例顯著升高。隨著感染進(jìn)程深入,CD4+和CD8+T細(xì)胞表面激活標(biāo)志CD69, CD44, CD40L的表達(dá)上調(diào),幼稚T細(xì)胞標(biāo)志CD62L的表達(dá)下調(diào)；而CD4+/CD25+/Foxp3+T細(xì)胞(Treg)比例持續(xù)上升。感染組脾臟T細(xì)胞增殖能力顯著低于正常組水平(P0.05)。結(jié)果表明,原頭節(jié)感染Balb/c小鼠免疫系統(tǒng)環(huán)境發(fā)生了微妙改變,這種變化在慢性感染階段表現(xiàn)尤為明顯。伴隨著感染,T細(xì)胞被逐漸激活,但同時(shí)一些免疫抑制細(xì)胞如Treg、MDSC的比例持續(xù)增加,影響宿主針對(duì)蟲(chóng)體抗原物質(zhì)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究提示這些抑制性細(xì)胞在E. granulosus長(zhǎng)期感染過(guò)程中可能發(fā)揮著極其重要的但尚被忽視的免疫下調(diào)作用。第二部分細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)感染小鼠M-MDSC源免疫調(diào)控分子的篩選髓源抑制性細(xì)胞(Meyloid-derived suppressor cells, MDSC)是一群異質(zhì)性細(xì)胞,來(lái)源于骨髓祖細(xì)胞和未成熟細(xì)胞,是DC、Macrophag e、粒細(xì)胞的前體。大量研究表明,MDSC在腫瘤模型中發(fā)揮著強(qiáng)大的免疫抑制作用。在第一部分,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)感染可誘導(dǎo)MDSC在Balb/c、鼠外周血和脾臟中顯著富集,有助于E. granulosus抑制宿主抗蟲(chóng)體免疫應(yīng)答,但具體作用機(jī)制研究仍不清楚。最新研究表明,單核型MDSC (monocytic-type MDSC, M-MDSD)是MDSC發(fā)揮免疫抑制作用的主要細(xì)胞群。本研究將以M-MDSC為模型,利用小鼠全基因表達(dá)譜篩選M-MDSC免疫調(diào)控相關(guān)分子,為E. granulosus免疫逃避機(jī)制提供新的見(jiàn)解。收集E. granulosus原頭節(jié)不同感染階段Balb/c小鼠脾臟以及對(duì)應(yīng)正常組小鼠脾臟,制備單細(xì)胞懸液,利用磁珠分選技術(shù)分離M-MDSC,提取總RNA進(jìn)行小鼠全基因組表達(dá)譜分析。利用生物信息學(xué)對(duì)感染前后M-MDSC差異基因進(jìn)行注釋及功能分析,并利用Real-time PCR驗(yàn)證基因差異表達(dá)情況。結(jié)果表明,感染前后M-MDSC存在1090個(gè)差異基因。Real-time PCR驗(yàn)證了27個(gè)差異基因,其中24個(gè)與芯片結(jié)果相符。蛋白網(wǎng)絡(luò)分析表明感染M-MDSC趨化能力和轉(zhuǎn)錄能力均減弱,可能影響M-MDSC的正常分化。同時(shí),獲得了一批潛在功能分子,其差異表達(dá)可能影響DC、Mφ功能以及與T細(xì)胞相互作用,是MDSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子基礎(chǔ)。第三部分細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)排泄分泌蛋白基因轉(zhuǎn)錄特征分析原頭節(jié)是細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)階段,具有“雙向發(fā)育”的能力,能夠感染、適應(yīng)多種哺乳動(dòng)物宿主,成為寄生蟲(chóng)-宿主相互作用研究的重要模型。眾所周知,蟲(chóng)體排泄分泌蛋白(excretory-secretory proteins, ESPs)在寄生蟲(chóng)-宿主互作過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,是寄生蟲(chóng)疫苗、診斷、藥物的重要靶標(biāo)。但由于ESPs成分復(fù)雜,蛋白表達(dá)豐度不一,以及宿主蛋白的干擾等原因,利用蛋白質(zhì)組學(xué)不能完全解析ESPs組分。本研究利用454測(cè)序技術(shù)對(duì)綿羊流行株G1型細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序,結(jié)合生物信息學(xué)方法重點(diǎn)分析了潛在ESPs基因轉(zhuǎn)錄特征,為全面了解細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)生理學(xué)適應(yīng)性奠定基礎(chǔ)。抽取細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDN A。采用GS-FLX Titanium General Library Preparation Kit構(gòu)建cDNA文庫(kù),利用Roche 454 GS-FLX Titanium平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)除去低質(zhì)量Reads及測(cè)序接頭后拼接、組裝成原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄本。生物信息學(xué)方法提取轉(zhuǎn)錄本中潛在ESPs,探索其在原頭節(jié)生理適應(yīng)過(guò)程中的作用。本研究共獲得26514條Unigene,其中,22910條(86.4%)成功地比對(duì)到新近發(fā)布的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)基因組序列,17705條(66.8%)分布在序列編碼區(qū)域。從原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄本中共預(yù)測(cè)到2280條ESPs,138、124條分別參與碳水化合物、蛋白質(zhì)代謝。其中,11種ESPs作為胞內(nèi)酶參與調(diào)節(jié)糖酵解／糖異生作用；高表達(dá)的ESPs轉(zhuǎn)錄本包括44種抗原性蛋白,25種分子伴侶以及4種蛋白酶。此外,一些ESPs參與發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路,如TGF-β受體通路,insulin信號(hào)通路等。本研究表明原頭節(jié)分泌的ESPs不僅參與介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答,而且參與碳水化合物代謝、抵抗敵對(duì)的宿主內(nèi)環(huán)境以及參與發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路。研究結(jié)果將深化寄生蟲(chóng)生理適應(yīng)性的認(rèn)識(shí),為包蟲(chóng)病診斷、疫苗、藥物新靶標(biāo)的篩選提供新的思路。結(jié) 論本課題從宿主-病原相互作用關(guān)系入手,探索細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)原頭節(jié)免疫逃避機(jī)制及生理適應(yīng)性,取得了如下結(jié)果：1.運(yùn)用多色流式細(xì)胞術(shù)揭示E. granulosus原頭節(jié)感染后Balb/c小鼠脾臟和外周血中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和激活過(guò)程中的關(guān)鍵事件：(1) APCs表面MHCⅡ分子表達(dá)明顯下調(diào),可能影響寄生蟲(chóng)抗原遞呈；(2)感染雖能持續(xù)激活T細(xì)胞,但免疫抑制性細(xì)胞群(如Treg, MDSC)富集可能抑制其免疫應(yīng)答反應(yīng)。2.采用Agilent小鼠芯片篩選E. granulosus原頭節(jié)感染前后M-MDSC差異表達(dá)分子,發(fā)現(xiàn)原頭節(jié)感染明顯下調(diào)小鼠M-MDSC的趨化及轉(zhuǎn)錄相關(guān)分子表達(dá),影響其正常分化及成熟；此外,一些差異表達(dá)分子可能影響其與T細(xì)胞相互作用,是M-MDSC發(fā)揮免疫調(diào)控的分子基礎(chǔ)。3.利用Roche 454測(cè)序解析了E. granulosi ts原頭節(jié)潛在排泄分泌蛋白(ESPs)基因轉(zhuǎn)錄特征：原頭節(jié)分泌的ESPs不僅參與介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答,而且參與碳水化合物代謝、抵抗敵對(duì)的宿主內(nèi)環(huán)境以及參與發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路。研究結(jié)果深化了寄生蟲(chóng)生理適應(yīng)性認(rèn)識(shí),為包蟲(chóng)病診斷、疫苗、藥物新靶標(biāo)的篩選提供新的思路。
[Abstract]:Echinococcus granulosus ( Echinococcus granulosus ) has become a global public health problem . In addition , it can infect and adapt to various mammalian hosts . In addition , it can infect and adapt to various mammalian hosts .
In this study , the expression of CD69 , CD44 , CD40L and the expression of CD69 , CD44 and CD40L on CD4 + and CD8 + T cells were detected by multi - color flow cytometry , and the expression of CD69 , CD44 and CD40L was regulated by multi - color flow cytometry .
In the first part , we found that MDSC can induce MDSC to play an important role in immune response in Balb / c mice . In this study , we sequenced the expression of M - MDSC . The results showed that there were 1090 differentially expressed genes in M - MDSCs .
In addition , some ESPs are involved in the development of related signaling pathways , such as TGF - 尾 receptor pathway , insulin signaling pathway , etc . The study shows that ESPs are not only involved in mediating host immune response , but also involved in carbohydrate metabolism , resistance to hostile host internal environment and key signal pathways involved in development .
( 2 ) Although T cells were continuously activated by infection , the enrichment of immunosuppressive cells ( such as Treg , MDSC ) could inhibit the immune response .
In addition , some differentially expressed molecules may influence their interaction with T cells , which is a molecular basis for the immune regulation of M - MDSCs . ESPs secreted by the primary segment are not only involved in mediating host immune responses but also participating in carbohydrate metabolism , resisting hostile host internal environment and key signal pathways involved in development .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R532.32

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4 高s，

本文編號(hào)：1961255