本文選題：T細(xì)胞亞群 + 共刺激分子��； 參考：《蘇州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病,廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲,被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的熱帶病之一(Neglected Tropical Diseases,NTD)。血吸蟲(chóng)病致病的中心環(huán)節(jié)是肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫和繼發(fā)的肝臟纖維化,其原因主要是由于T淋巴細(xì)胞細(xì)胞亞群分化和功能異常介導(dǎo)的免疫病理?yè)p傷,特別是CD4+T(Th)亞群在感染不同階段改變介導(dǎo)了持續(xù)對(duì)蟲(chóng)卵抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答所致病理改變,但確切的機(jī)制尚待探討。已有研究表明,Th1/Th2免疫偏移與血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷——蟲(chóng)卵肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展及其免疫調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)。Th17和Tfh是近年來(lái)備受關(guān)注的參與血吸蟲(chóng)感染免疫和病理進(jìn)程相關(guān)的Th細(xì)胞亞群。因此,宿主感染血吸蟲(chóng)后誘發(fā)Th細(xì)胞亞群(Th1/Th2/Th17/Tfh)功能的失衡可能是血吸蟲(chóng)免疫病理機(jī)制的重要因素,值得進(jìn)一步探討。迄今對(duì)于T細(xì)胞免疫應(yīng)答在血吸蟲(chóng)感染免疫應(yīng)答的研究絕大多數(shù)集中于CD4+T細(xì)胞及其亞群,而對(duì)于CD8+T細(xì)胞研究甚少。有研究認(rèn)為,CD8+T細(xì)胞在曼氏血吸蟲(chóng)感染宿主過(guò)程中可能具有抑制免疫病理的作用,但尚未有確切證據(jù)證實(shí)。因此,研究T細(xì)胞亞群在血吸蟲(chóng)病不同病理階段的改變和介導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型,尋找調(diào)控T細(xì)胞亞群免疫失衡的靶點(diǎn),對(duì)防治血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷,研究和尋找新的免疫干預(yù)措施具有十分重要的意義。業(yè)已證明,T細(xì)胞的有效活化和功能介導(dǎo)需要雙重信號(hào)的協(xié)同作用:一是抗原肽—MHC復(fù)合物,被T細(xì)胞抗原受體(TCR)識(shí)別;二是共刺激信號(hào),由抗原提呈細(xì)胞(APC)和T細(xì)胞表面的共刺激分子配體和受體相互作用所介導(dǎo)�？烧T導(dǎo)共刺激分子(Inducible costimulator mocule,ICOS)和程序性死亡受體1(Programmed death-1,PD-1)是介導(dǎo)T細(xì)胞有效激發(fā)、適度效應(yīng)和適時(shí)中止的重要的正性和負(fù)性調(diào)控分子,共刺激分子與其配體(ICOS/ICOSL和PD-1/PD-L1)介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)宿主調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答起重要作用,因而成為腫瘤免疫、感染免疫和自身免疫性疾病的研究熱點(diǎn)。本課題以血吸蟲(chóng)感染小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,以t細(xì)胞亞群為主線,探討t細(xì)胞和相關(guān)免疫分子特別是正性共刺激分子icos/icosl和負(fù)性共刺激分子pd-1/pd-l1,在血吸蟲(chóng)感染以及再感染不同階段的作用,研究其與血吸蟲(chóng)所致宿主免疫病理變化的相關(guān)性,并進(jìn)一步觀察對(duì)血吸蟲(chóng)感染模型進(jìn)行icos/icosl和pd-1/pd-l1信號(hào)途徑體內(nèi)干預(yù)的研究,探討正性共刺激信號(hào)icos和負(fù)性共刺激信號(hào)pd-1對(duì)血吸蟲(chóng)感染宿主關(guān)鍵的免疫病理?yè)p傷——蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)的調(diào)控作用,為血吸蟲(chóng)病病理?yè)p傷的免疫干預(yù)提供新的思路。第一部分t細(xì)胞亞群和相關(guān)分子在血吸蟲(chóng)感染小鼠模型中的表達(dá)及與肝臟病理變化的相關(guān)性目的:觀察血吸蟲(chóng)感染小鼠不同階段t細(xì)胞亞群和th亞群(th1/th2/th17/tfh)以及相關(guān)分子的表達(dá)變化,平行性觀察感染不同階段血吸蟲(chóng)病肝臟病理變化。方法:balb/c小鼠以腹部貼片法建立血吸蟲(chóng)感染動(dòng)物模型;采用多參數(shù)熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血吸蟲(chóng)感染小鼠不同階段t細(xì)胞亞群、th細(xì)胞亞群(th1/th2/th17/tfh)以及共刺激分子icos/icosl和pd-1/pd-l1的表達(dá);應(yīng)用熒光定量pcr的方法檢測(cè)同期小鼠th亞群(th1/th2/th17/tfh)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平;采用免疫組化he染色觀察血吸蟲(chóng)主要免疫病理?yè)p傷——肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的反應(yīng)進(jìn)程,分析其與t細(xì)胞亞群、th亞群(th1/th2/th17/tfh)以及共刺激分子icos/icosl、pd-1/pd-l1表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果:(1)小鼠肝臟免疫組化he染色,對(duì)不同階段感染小鼠的肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫面積的分析表明,血吸蟲(chóng)病感染后8w,宿主對(duì)于血吸蟲(chóng)免疫應(yīng)答的蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)最強(qiáng)。(2)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,感染血吸蟲(chóng)后3w小鼠外周血和脾臟cd4+t細(xì)胞下降,cd8+t細(xì)胞升高,于感染第8w達(dá)最高值;(3)小鼠脾臟和淋巴結(jié)中tfh從感染3周即出現(xiàn)升高,而外周血tfh感染8w后升高。感染小鼠血清中特異性抗體水平igg與脾臟tfh細(xì)胞比例成正相關(guān)。(4)th1細(xì)胞因子ifn-γ于感染1w即升高,于第5w(蟲(chóng)卵形成期)出現(xiàn)下調(diào),隨后逐漸下降;th2型細(xì)胞因子il-4以及th17型細(xì)胞因子il-17均于感染6w后升高,并持續(xù)維持在較高水平;tfh型細(xì)胞因子il-21于感染3w出現(xiàn)升高,感染10w達(dá)到峰值,感染后期維持在較高水平;脾臟中th1/th2/th17/tfh特異性轉(zhuǎn)錄因子(tbet/roryt/gata3/bcl-6)動(dòng)態(tài)變化與其相應(yīng)細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化一致;(5)cd4+t細(xì)胞上共刺激分子icos和pd-1在血吸蟲(chóng)感染后表達(dá)上調(diào);其配體在cd19+b細(xì)胞上調(diào)表達(dá)。結(jié)論:血吸蟲(chóng)感染引起宿主cd4+t細(xì)胞的降低和cd8+t細(xì)胞的升高;宿主t細(xì)胞免疫應(yīng)答感染初期以th1應(yīng)答為主,隨著病程進(jìn)入蟲(chóng)卵抗原產(chǎn)生至宿主肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的形成和發(fā)展,th2、th17、tfh免疫應(yīng)答增強(qiáng),t細(xì)胞表面共刺激分子pd-1和icos表達(dá)顯著升高,其配體表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)卵肉芽腫與cd8+t比例關(guān)系密切,特異性抗體水平igg與脾臟tfh細(xì)胞比例成正相關(guān),值得進(jìn)一步探討。第二部分t細(xì)胞亞群和相關(guān)分子在血吸蟲(chóng)再感染小鼠模型的表達(dá)及與病理變化的相關(guān)性目的:分析宿主初次感染、再感染及化療后體內(nèi)t細(xì)胞亞群、th細(xì)胞亞群(th1/th2/th17/tfh)和共刺激分子表達(dá)水平的變化,探討t細(xì)胞亞群、th細(xì)胞和共刺激分子icos和pd-1在血吸蟲(chóng)再感染宿主中免疫應(yīng)答的特征,為尋找預(yù)防血吸蟲(chóng)再感染和抑制宿主免疫病理的干預(yù)措施奠定基礎(chǔ)。方法:balb/c小鼠以腹部貼片法建立小鼠初次感染、再感染和治療后的動(dòng)物模型。采用流式細(xì)胞術(shù)觀察血吸蟲(chóng)感染小鼠在再感染、初次感染及化療后狀態(tài)下體內(nèi)t細(xì)胞亞群、th細(xì)胞亞群以及共刺激分子pd-1和icos的的表達(dá)水平;免疫組化方法觀察感染小鼠的血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫的病理變化;探討t細(xì)胞亞群、th細(xì)胞亞群及icos/icosl和pd-1/pd-l1與再感染狀態(tài)下免疫病理變化的相關(guān)性。結(jié)果:(1)化療組小鼠外周血和脾臟cd4+t比例較感染組小鼠升高,cd8+t比例較感染組小鼠降低,icos/icosl和pd-1/pd-l1的表達(dá)較感染組均下調(diào),il-4、il-17均出現(xiàn)不同程度的降低,而ifn-γ無(wú)明顯改變,由此表明化療組小鼠的th2/th17/tfh型免疫反應(yīng)均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì);(2)再感染組小鼠外周血和脾臟中cd4+t比例較初次感染組比例升高,cd8+t比例降低,外周血icos和pd-1與初次感染組比較沒(méi)有顯著性差異,而脾臟cd4+t上icos和pd-1上調(diào)表達(dá);再感染組與初次感染組比較ifn-γ和il-4未見(jiàn)顯著性差異,而再感染組il-17和il-21型細(xì)胞因子較初次感染組低;(3)血吸蟲(chóng)再感染小鼠較初次感染小鼠的蟲(chóng)荷數(shù)減少,初次感染對(duì)于再感染宿主有19.9%的保護(hù)率;再感染組小鼠肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫的面積與初次感染組無(wú)差別。結(jié)論:再感染宿主t細(xì)胞亞群以及th細(xì)胞亞群與初次感染時(shí)呈現(xiàn)出不同的特征,再感染宿主cd4+t比例較初次感染時(shí)升高,cd8+t比例雖仍高于正常對(duì)照組,但與初次感染相比出現(xiàn)下降,th17和tfh免疫應(yīng)答反應(yīng)較初次感染時(shí)下調(diào),而外周血和脾臟cd4+t細(xì)胞共刺激分子pd-1和icos的表達(dá)較初次感染時(shí)上調(diào),其配體表達(dá)與初次感染無(wú)明顯差異。第三部分icos/icosl和pd-1/pd-l1信號(hào)體內(nèi)干預(yù)及聯(lián)合砒喹酮治療對(duì)血吸蟲(chóng)感染小鼠作用及機(jī)制研究目的:觀察icos/icosl和pd-1/pd-l1信號(hào)體內(nèi)干預(yù)及聯(lián)合砒喹酮治療對(duì)血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷的治療作用,探討pd-1/pd-l1信號(hào)激發(fā)聯(lián)合砒喹酮治療對(duì)減輕血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷的可能作用機(jī)理,為血吸蟲(chóng)病肝臟病理?yè)p傷的免疫干預(yù)措施提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:對(duì)balb/c小鼠的血吸蟲(chóng)感染模型在感染6w(蟲(chóng)卵肉芽腫形成期)時(shí)進(jìn)行icos/icosl和pd-1/pd-l1信號(hào)的體內(nèi)干預(yù)。血吸蟲(chóng)感染小鼠進(jìn)行正性共刺激信號(hào)icos阻斷(icos阻斷性抗體,anti-icoslmab)或負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)(pd-l1重組蛋白,pd-l1.fc)的干預(yù)措施,同時(shí)聯(lián)合砒喹酮進(jìn)行殺蟲(chóng)治療,觀察正性信號(hào)icos和負(fù)性信號(hào)pd-1干預(yù)對(duì)血吸蟲(chóng)病治療作用和免疫病理?yè)p傷的影響;由于發(fā)現(xiàn)負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)(pd-l1.fc)和吡喹酮聯(lián)合干預(yù)能明顯減輕和抑制肝臟病理?yè)p傷,因此進(jìn)一步在小鼠感染血吸蟲(chóng)的不同階段(感染3w、6w、12w),采用增強(qiáng)pd-1信號(hào)的pd-l1.fc和阻斷pd-1信號(hào)的anti-pd-l1mab對(duì)pd-1/pd-l1信號(hào)激發(fā)或者阻斷干預(yù),采用流式細(xì)胞術(shù)分析觀察干預(yù)后cd4+t、cd8+t、cd19+b細(xì)胞的變化以及病理形態(tài)分析,觀察其對(duì)病理?yè)p傷的影響。結(jié)果:(1)正性信號(hào)抑制(anti-icoslmab)聯(lián)合吡喹酮治療小鼠肝臟肉芽腫面積與單獨(dú)砒喹酮治療組小鼠無(wú)顯著性差異;(2)吡喹酮聯(lián)合負(fù)性信號(hào)增強(qiáng)即pd-l1.fc干預(yù)組小鼠肝臟肉芽腫面積低于單獨(dú)砒喹酮治療組小鼠,由此表明pd-l1信號(hào)增強(qiáng)干預(yù)可顯著減輕血吸蟲(chóng)感染小鼠蟲(chóng)卵肉芽腫的病理?yè)p傷;(3)在此基礎(chǔ)上,對(duì)小鼠感染血吸蟲(chóng)不同階段(3w、6w和12w)進(jìn)行pd-1/pd-l1信號(hào)阻斷(anti-pd-l1mab)的免疫干預(yù),結(jié)果顯示小鼠外周血、脾臟pd-1分子在cd4+t和cd8+t淋巴細(xì)胞表面表達(dá)下調(diào)、pdl-1分子在cd19+b細(xì)胞表達(dá)下調(diào),在不同階段負(fù)性阻斷干預(yù)對(duì)血吸蟲(chóng)病肝臟病理沒(méi)有顯著影響,cd8+t細(xì)胞比例與感染組小鼠無(wú)顯著性差異;(4)對(duì)小鼠感染血吸蟲(chóng)不同階段(3w、6w和12w)進(jìn)行pd-1/pd-l1信號(hào)增強(qiáng)的免疫干預(yù),結(jié)果顯示小鼠外周血、脾臟pd-1分子在cd4+t和cd8+t淋巴細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)、pdl-1分子在cd19+b細(xì)胞表達(dá)上調(diào),在小鼠感染血吸蟲(chóng)3w和6w干預(yù)小鼠病理?yè)p傷減輕,pd-1/pd-l1信號(hào)增強(qiáng)的免疫干預(yù)組,cd8+t細(xì)胞比例明顯下降,尤其是pd-1/pd-l1信號(hào)增強(qiáng)聯(lián)合吡喹酮治療組,小鼠病理?yè)p傷顯著地減輕,并可殺滅成蟲(chóng),同時(shí)cd8+t細(xì)胞比例低于單獨(dú)干預(yù)組;而感染12w進(jìn)行干預(yù)對(duì)小鼠肝臟病理沒(méi)有明顯作用。結(jié)論:正性信號(hào)阻斷(anti-icoslmab)和負(fù)性信號(hào)阻斷(anti-pd-l1mab)對(duì)血吸蟲(chóng)感染小鼠的免疫病理沒(méi)有顯著影響;而pd-1/pd-l1信號(hào)增強(qiáng)(pd-l1.fc)聯(lián)合吡喹酮治療,殺成蟲(chóng)的同時(shí)可明顯減輕血吸蟲(chóng)感染小鼠蟲(chóng)卵肉芽腫的病理?yè)p傷,且cd8+t細(xì)胞明顯下降。同時(shí)證實(shí)pd-l1早期干預(yù)聯(lián)合吡喹酮治療血吸蟲(chóng)病可顯著減輕血吸蟲(chóng)感染引起的不可逆的肝臟病理?yè)p傷,有潛在的應(yīng)用前景。本論文研究表明,感染血吸蟲(chóng)宿主的免疫應(yīng)答過(guò)程中,t細(xì)胞亞群隨著疾病病程進(jìn)展過(guò)程而變化,呈現(xiàn)cd4+t細(xì)胞持續(xù)下降,cd8+t細(xì)胞升高的特征,尤其在蟲(chóng)卵肉芽腫反應(yīng)最強(qiáng)的8w,cd8+t細(xì)胞也達(dá)到最高值;伴隨著疾病從急性向慢性反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸,th細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化和調(diào)節(jié)呈現(xiàn)出與慢性感染性疾病一致的特征,即在感染初期誘導(dǎo)以th1為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答,感染后期th2/th17/tfh免疫應(yīng)答增強(qiáng)并對(duì)宿主的免疫病理?yè)p傷起重要的調(diào)節(jié)作用;本研究首次發(fā)現(xiàn)pd-1/pd-l1信號(hào)的增強(qiáng)可明顯減輕血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷,且引起感染宿主體內(nèi)cd8+t的降低,pd-l1.fc聯(lián)合血吸蟲(chóng)化療藥物吡喹酮不僅可殺滅成蟲(chóng),也顯著改善血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷。綜上所述,本論文動(dòng)態(tài)地分析了血吸蟲(chóng)感染小鼠模型t細(xì)胞亞群的變化規(guī)律,探討了共刺激分子icos/icosl和pd-1/pd-l1在血吸蟲(chóng)病免疫病理的表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制,發(fā)現(xiàn)pd-1/pd-l1信號(hào)的增強(qiáng)可明顯減輕血吸蟲(chóng)病免疫病理?yè)p傷,提示血吸蟲(chóng)感染所致的肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫,繼而發(fā)展為肝臟纖維化病變,與過(guò)度的炎癥損傷相關(guān),而pd-1可有效地調(diào)控過(guò)度的炎癥反應(yīng)及產(chǎn)生的病理?yè)p傷。本研究提出了靶向共刺激信號(hào)pd-1/pd-l1聯(lián)合吡喹酮化療的干預(yù)措施,這不僅為血吸蟲(chóng)病免疫病理機(jī)制研究提出新的思路,而且為預(yù)防和治療血吸蟲(chóng)病病理?yè)p害提供新的治療方案。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R532.21

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本文編號(hào)：1801505