本文選題：逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增 + 快速檢測�。� 參考：《安徽大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：禽流感(Avian influenza, AI)是由正粘病毒科流感病毒屬A型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)所引起的一種禽類呼吸道疾病綜合征,1878年首次報道于意大利,然后在世界范圍內(nèi)廣泛存在,對很多國家和地區(qū)的經(jīng)濟增長以及公共衛(wèi)生安全造成了嚴重的影響。近年來,由H5N1亞型高致病性禽流感病毒引發(fā)的禽流感疫情影響嚴重,對全球經(jīng)濟增長和人類公共安全已構(gòu)成了重大威脅,比如1997年香港首次報道的感染人的H5N1亞型禽流感病毒,自2003年以來又在全球15個國家內(nèi)造成了648人感染、384人死亡的大流行。另外,2005年在中國青海湖爆發(fā)的H5N1亞型高致病性禽流感則造成了6000多只遷徙的候鳥死亡。而H7亞型禽流感病毒引起的禽流感大爆發(fā)也對許多國家和地區(qū)造成了重大危害,導(dǎo)致了七千五百多萬的家禽死亡,而且也感染了很多人甚至導(dǎo)致其死亡。此外,2013年中國爆發(fā)的人感染H7N9亞型高致病性禽流感病毒的疫情,是全球首次報道,隨之在中國多省份相繼暴發(fā),到目前為止已經(jīng)造成超過100人死亡的悲劇。 目前禽流感病毒的檢測方法主要包括病毒學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)等方法,但是其中很多方法操作繁瑣,且費時費力,又需要昂貴的儀器設(shè)備,因此不適合在基層快速的檢測禽流感病毒,也很不利于對禽流感疫情的有效監(jiān)測和控制。2000年日本Notimi T博士在普通PCR方法的基礎(chǔ)上發(fā)明了一種新型核酸擴增技術(shù),即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),它根據(jù)靶序列的六個特定區(qū)域設(shè)計特異的四個引物,在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶的作用下,65℃恒溫條件反應(yīng)一小時就可完成目的基因的擴增,并且擴增結(jié)果僅用肉眼就能直接判斷實驗結(jié)果,因此LAMP技術(shù)具有簡便、快速、高特異性和高靈敏度等優(yōu)點,特別適合在設(shè)備不完善的基層實驗室使用。 本研究在前期LAMP研究的基礎(chǔ)上,運用了一種新的擴增產(chǎn)物結(jié)果判斷方法,即通過實時定量PCR儀觀察反應(yīng)熒光強度變化,并根據(jù)此結(jié)果判定及優(yōu)化最佳反應(yīng)體系。本實驗所使用的熒光染料是鈣黃綠素,肉眼觀察時陽性反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)液顏色會由橙黃色變?yōu)闇\綠色。本研究以H5亞型禽流感病毒和H7亞型禽流感病毒的各自HA基因序列以及禽流感病毒的保守M基因序列作為靶基因序列,對它們進行序列比對并找出各自的高度保守區(qū)域,然后利用PrimerExplorerV4在線引物設(shè)計軟件分別設(shè)計了針對每個靶基因的多組LAMP特異性引物,每組引物都包括一對外引物F3和B3、一對內(nèi)引物FIP和BIP以及一對環(huán)引物L(fēng)F和LB。對每個靶基因的兩組引物進行重復(fù)試驗,選取最佳的一組引物。然后對反應(yīng)溫度、Mg++濃度、dNTP濃度和甜菜堿濃度等擴增條件進行優(yōu)化,根據(jù)熒光強度變化強弱和1.5%瓊脂糖凝膠電泳條帶的寬度和亮度進行結(jié)果篩選,成功建立了每組引物的最優(yōu)LAMP反應(yīng)體系,即M-RT-LAMP的的最優(yōu)反應(yīng)體系是：6mM/L Mg2+,1.6mM/L dNTP,0.6M/L Betaine,1.6μM/L FIP,BIP,0.2μM/L F3,B3,0.8μM/L LF,LB,最適溫度63℃；H5-RT-LAMP的最優(yōu)反應(yīng)體系為：6mM/L Mg2+,1.4mM/L dNTP,0.8M/L Betaine,1.6μM/L FIP,BIP,0.4μM/L F3,B3,0.8μM/L LF, LB,最適溫度65℃；H7-RT-LAMP的最優(yōu)反應(yīng)體系是：6mM/L Mg2+,1.4mM/L dNTP,0.8M/L Betaine,1.6μM/L FIP,BIP,0.2μM/L F3,B3,0.8μM/L LF, LB,最適溫度65℃。在反應(yīng)前將熒光染料混合液(Calcein/MnCl2)加入到反應(yīng)體系中,然后將每組反應(yīng)體系在其最適溫度反應(yīng)60min,然后80℃、5min以終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,通過熒光強度變化、肉眼直接觀察顏色變化或經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增結(jié)果的判斷。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系,對H1, H3, H4, H5, H6, H7, H9亞型禽流感病毒和新城疫病毒進行RT-LAMP特異性檢測,試驗結(jié)果只能檢測到目的基因的存在,說明所建立的AIV-RT-LAMP方法具有良好的特異性。將各亞型禽流感病毒RNA進行十倍倍比稀釋,然后用同一RNA進行RT-LAMP和RT-PCR實驗以比較RT-LAMP方法的靈敏性,結(jié)果表明本研究建立的M-RT-LAMP體系的靈敏度為0.01pg,是RT-PCR方法的1000倍；H5-RT-LAMP體系其最低檢測限為0.1pg,是RT-PCR方法的100倍；H7-RT-LAMP體系其最低檢測限是O.1pg,比RT-PCR方法靈敏100倍。用80份臨床樣品對所建立的AIV-RT-LAMP檢測方法進行技術(shù)評價,并與RT-PCR方法進行檢測陽性率的比較,結(jié)果說明本研究所建立的AIV-RT-LAMP技術(shù)是有效的且可行的。 綜上所述,本研究建立的AIV-RT-LAMP快速檢測禽流感病毒的方法是可行的,并且該方法具有快速、簡便、靈敏度高和特異性好等優(yōu)勢,特別適合在基層及現(xiàn)場使用,為禽流感疫情的預(yù)警和早期診斷提供了便利。
[Abstract]:Avian influenza (AI) is a kind of avian respiratory disease syndrome caused by the A avian influenza virus (Avian influenza virus, AIV), which is first reported in Italy in 1878, and then widely existed worldwide. It is an economic growth and public health security for a large number of countries and regions. In recent years, the epidemic of avian influenza caused by the H5N1 subtype highly pathogenic avian influenza virus has been seriously affected, and has posed a major threat to global economic growth and human public safety. For example, the first reported avian influenza virus (H5N1), which was first reported in Hongkong in 1997, has been caused in 15 countries in the world since 2003. 648 people were infected with 384 deaths. In addition, the H5N1 subtype of highly pathogenic avian influenza, which broke out in Qinghai Lake in China in 2005, resulted in the death of more than 6000 migratory migratory birds, and the outbreak of avian influenza caused by the H7 subtype avian influenza virus was also a major hazard to many countries and regions, resulting in the death of about seventy-five million poultry. In addition, the outbreak of the H7N9 subtype highly pathogenic avian influenza virus in China in 2013 was the first report in the world, and the outbreak of the outbreak in many provinces in China has caused more than 100 deaths so far.
At present, the detection methods of avian influenza virus mainly include virology, serology and molecular biology, but many of them are complicated, time-consuming and costly, and need expensive equipment. Therefore, it is not suitable for rapid detection of avian influenza virus at the grass-roots level, and it is also not conducive to the effective monitoring and control of the epidemic of avian influenza in.2000 years. On the basis of the common PCR method, Dr. Notimi T invented a new type of nucleic acid amplification technology, namely, loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which designed four specific primers based on six specific regions of the target sequence, and at 65 C under the action of Bst DNA polymerase with chain replacement activity. The amplification of the target gene can be completed in one hour by the temperature condition, and the result of the amplification can be directly judged by the naked eye. Therefore, the LAMP technology has the advantages of simple, rapid, high specificity and high sensitivity, and is especially suitable for the basic laboratory of imperfect equipment.
On the basis of the earlier LAMP study, a new method of determining the result of the amplification product was used to determine the change of the fluorescence intensity by real-time quantitative PCR instrument, and to determine and optimize the optimal reaction system according to the results. Color will change from orange yellow to light green. In this study, the sequence of H5 subtype avian influenza virus and H7 subtype avian influenza virus and the sequence of the conservative M gene of avian influenza virus were used as the target gene sequence, and the sequence alignment of the avian influenza virus was compared and the highly conserved regions were found. Then the PrimerExplorerV4 online primer was used to design the software. LAMP specific primers for each target gene were designed for each target gene. Each primer consisted of one external primer F3 and B3, a pair of primers FIP and BIP, and a pair of ring primers LF and LB. to repeat two primers for each target gene and select the best set of primers. Then the reaction temperature, Mg++ concentration, dNTP concentration and betaine were selected. Optimization of the concentration and other amplification conditions, according to the intensity of fluorescence intensity change and the width and brightness of the 1.5% agarose gel electrophoresis strip, the optimal LAMP reaction system for each primer was established successfully, that is, the optimal reaction system of M-RT-LAMP was 6mM/L Mg2+, 1.6mM/ L dNTP, 0.6M/L Betaine, 1.6 Mu M/L FIP, BIP, 0.2 micron. 3,0.8 M/L LF, LB, the optimum temperature at 63 degrees C. The optimal reaction system for H5-RT-LAMP is 6mM/L Mg2+, 1.4mM/L dNTP, 0.8M/L Betaine, 1.6 micron M/L. F, LB, the optimum temperature at 65 C. The fluorescent dye mixture (Calcein/MnCl2) was added to the reaction system before the reaction. Then each reaction system was reacted at 60min at its optimum temperature, and then at 80, 5min to terminate the reaction. After the reaction ended, the color changes were observed directly by the naked eye, or by 1.5% agarose gel electrophoresis. H1, H3, H4, H5, H6, H7, H9 subtype of avian influenza virus and Newcastle disease virus were detected by the optimized reaction system. The result of the test can only detect the existence of the target gene, which shows that the established AIV-RT-LAMP method has a good specificity. Ten avian influenza virus RNA is carried out. Double times dilution, then using the same RNA for RT-LAMP and RT-PCR experiments to compare the sensitivity of the RT-LAMP method. The results show that the sensitivity of the M-RT-LAMP system is 0.01pg, 1000 times the RT-PCR method, and the minimum detection limit for H5-RT-LAMP system is 0.1pg, 100 times the RT-PCR square method, and the lowest detection limit for H7-RT-LAMP system is that O.1pg is 100 times more sensitive than the RT-PCR method. A technical evaluation of the established AIV-RT-LAMP detection method with 80 clinical samples and the comparison with the positive rate of the RT-PCR method are compared. The results show that the AIV-RT-LAMP technology established in this study is effective and feasible.
To sum up, the method of rapid detection of avian influenza virus by AIV-RT-LAMP in this study is feasible, and the method has the advantages of fast, simple, high sensitivity and good specificity. It is especially suitable for use in the grass-roots and site, and provides convenience for early warning and early diagnosis of avian influenza epidemic.

【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R511.7

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