本文選題：侵襲性念珠菌病 + 白念珠菌��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：背景 念珠菌屬是引起院內血流感染的第4位致病菌,在ICU病人中上升為第3位致病菌,其中白念珠菌仍是最常見的致病菌(占50%-70%)。侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis,IC)起病隱匿,缺乏早期特異癥狀,給臨床診斷帶來困難,不能進行及時有效的治療,侵襲性念珠菌病的死亡率可高達40%。缺乏早期有效的實驗室診斷指標是造成IC診斷困難的重要原因。目前血培養(yǎng)和組織活檢被認為是IC的實驗室診斷“金標準”,其中血培養(yǎng)敏感性差、耗時長,且不伴有念珠菌血癥的深部念珠菌病患者會出現漏診,往往延誤病人診斷和治療；組織活檢為創(chuàng)傷性檢查,危重病人難以承受。研究證明,及時的診斷和治療能有效改善IC病人的預后,因此迫切需要尋找可靠有效的IC實驗室診斷標志物并建立其檢測方法,提高IC的實驗室診斷水平。近20年來,以念珠菌特異抗原和抗體為檢測對象的血清學方法,憑借其敏感、簡便、易于開展的優(yōu)勢,成為IC實驗室診斷研究領域的熱點。念珠菌抗原檢測可以為IC診斷提供直接的依據,理想的抗原標志物還可以用來監(jiān)測治療效果和判斷預后�，F有用于IC診斷的抗原指標(1,3)-p-D-葡聚糖和甘露聚糖敏感性和特異性尚不理想,尋找新的診斷標志物可以提高IC的實驗室診斷水平。 白念珠菌烯醇化酶(‘cnolase, Eno)由440個氨基酸組成,分子量在45-48kD之間,催化2-磷酸甘油酸脫水生成磷酸烯醇式丙酮酸,同時在糖異生過程中催化逆向反應。果糖二磷酸醛縮酶(fructose-bisphosphate aldolase, Fba)由359個氨基酸組成,分子量約為39kD,催化1,6-二磷酸果糖分解為磷酸二羥丙酮和3-磷酸甘油醛的可逆反應。Eno和Fba是糖酵解中的關鍵酶,在念珠菌能量代謝中起重要作用。Eno和Fba存在于念珠菌細胞壁與胞漿內,是白念珠菌中含量最豐富的可溶性蛋白,在白念珠菌呈菌絲相生長時,Eno和Fba表達明顯上調,提示兩者與白念珠菌侵襲生長相關,被認為是菌絲相特異蛋白。血清蛋白質組學分析顯示,Eno和Fba可引發(fā)機體強烈的免疫應答,產生高滴度的IgG抗體,是IC進程中的免疫優(yōu)勢抗原�；贓no和Fba具有以上的特點,我們認為Eno和Fba具有成為IC診斷標志物的潛在優(yōu)勢,在本研究中對兩者在IC中的診斷價值進行了評估。 目的 應用前期獲得的白念珠菌Eno、Fba多克隆抗體和單克隆抗體、白念珠菌Eno和Fba重組蛋白,建立定量檢測Eno和Fba的雙抗體夾心ELISA法。通過建立免疫正常和免疫抑制BALB/c小鼠侵襲性念珠菌感染模型,獲得Eno和Fba在IC中的動力學資料。檢測IC患者和健康對照血清中Eno和Fba水平,評估Eno和Fba在IC病人中的早期診斷價值。 方法 1.定量檢測Eno、Fba雙抗體夾心ELISA法建立 應用抗原偶聯NHS活化瓊脂糖純化羊抗Eno和羊抗Fba多克隆抗體,G蛋白親和層析柱純化抗Eno和抗Fba單克隆抗體。用不同念珠菌胞漿蛋白、重組蛋白Eno和重組蛋白Fba進行免疫印跡,檢測純化后的Eno和Fba單克隆及多克隆抗體的特異性。利用單克隆抗體作為包被抗體,HRP標記的多克隆抗體作為檢測抗體,重組蛋白作為標準品,建立定量檢測Eno和Fba的雙抗體夾心ELISA法,考察方法的精密度、特異性、線性范圍、最低檢測下限、血清回收率等性能指標。 2.體外真菌培養(yǎng)上清Eno和Fba定量檢測 應用建立的定量檢測Eno、Fba雙抗體夾心ELISA法檢測常見念珠菌和新型隱球菌、釀酒酵母培養(yǎng)上清液,對建立的雙抗體夾心ELISA檢測性能進行初步評價。 3.IC感染動物模型血清和腎勻漿Eno和Fba定量檢測 4-6周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為免疫抑制組(n=25)、免疫正常組(n=25)和正常對照組(11=5)。采用孢子注射前4天和當天,腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/Kg,孢子注射后隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺75mg/Kg的方法,建立小鼠的免疫抑制狀態(tài)。經尾靜脈接種5×106CFU/ml的白念珠菌標準菌株ATCC90028孢子混懸液0.1ml,建立免疫正常小鼠和免疫抑制小鼠IC感染模型,正常對照組注射等量無菌生理鹽水。收集感染后8h、Id、2d、3d、5d/、鼠血清和腎勻漿上清(每個時間點5只小鼠),進行Eno和Fba定量檢測,同時檢測WBC計數、血培養(yǎng)和腎真菌載量,獲得Eno和Fba在IC感染中的動力學資料。 4.IC病人血清定量檢測Eno和Fba 經血培養(yǎng)和臨床癥狀確診的IC病人92例,包括白念珠菌46例,近平滑念珠菌15例,熱帶念珠菌17例,其他念珠菌14例(光滑念珠菌6例、季也蒙念珠菌3例、角膜念珠菌2例、葡萄牙念珠茵1例,希木龍假絲酵母菌2例),收集血清200份,以健康體檢者(n=100)、念珠菌定植病人(n=30)血清為陰性對照,定量檢測血清Eno和Fba水平,確定cut off值并評估該法在侵襲性念珠菌病診斷中的應用價值。 結果 1.Eno抗體的特異性 Western blot結果顯示,Eno單抗和多抗能識別白念珠菌胞漿Eno和重組Eno蛋白,Eno單抗與近平滑念珠菌胞漿Eno有交叉反應,Eno多抗與熱帶念珠菌和近平滑念珠菌胞漿Eno有交叉反應。Fba單抗和多抗能識別白念珠菌胞漿Fba和重組Fba蛋白,與熱帶念珠菌和近平滑念珠菌胞漿Fba均有交叉反應。 2.定量檢測Eno雙抗體夾心法ELISA'性能指標 Eno濃度為25ng/ml和5ng/ml時,批內和批間精密度分別為6.72%、7.18%和10.4%和12.68%；最低檢測下限為1.25ng/ml;線性范圍為(1.25-50) ng/ml;標準品濃度為50ng/ml、25ng/m1和5ng/ml時,血清回收率分別為97.75%、122.84%和92.13%。 3.定量檢測Fba雙抗體夾心ELISA法性能指標 Fba濃度為50ng/ml和10ng/m1時,批內和批間精密度分別為6.88%、7.45%和9.72%和11.92%。最低檢測下限為2.5ng/ml,線性范圍為(2.5-100) ng/ml,標準品濃度為100ng/ml、50ng/ml和10ng/ml時,血清回收率分別為104.02%、102.84%和90.90%。 4.體外真菌培養(yǎng)上清Eno和Fba定量檢測 37℃培養(yǎng)24h,白念珠菌培養(yǎng)上清中可檢出Eno (3.06ng/ml),培養(yǎng)至120h,上清中Eno逐漸增至33.43ng/ml.37℃培養(yǎng)48h,近平滑念珠菌上清可檢測出少量Eno (1.03ng/ml),隨后一直保持低水平,培養(yǎng)至120h,上清Eno濃度為3.17ng/ml。37℃培養(yǎng)9h,白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠茵培養(yǎng)上清中可檢出Fba,濃度分別為2.60ng/ml、1.14ng/ml和2.19ng/ml,培養(yǎng)至120h,白念珠菌培養(yǎng)上清中Fba濃度達54.16ng/ml,熱帶念珠菌和近平滑念珠菌培養(yǎng)上清Fba呈現相同的緩慢增長趨勢,培養(yǎng)至120h,Fba濃度分別達13.60ng/ml和7.82ng/ml o在整個培養(yǎng)過程中,光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隱球菌和釀酒酵母培養(yǎng)上清內未檢測出Eno和Fba。25℃培養(yǎng)條件下白念珠茵的菌絲生長弱于37℃,培養(yǎng)上清中Eno和Fba水平始終低于37℃培養(yǎng)上清。說明Eno和Fba水平與白念珠菌菌絲生長呈正相關。 5.IC小鼠中Eno和Fba動力學資料 5.1IC小鼠中血清Eno和Fba陽性率 免疫抑制組和免疫正常組小鼠感染后8h均有60%(3/5)存在念珠菌血癥。免疫抑制組感染后1d,20%(1/5)小鼠仍有念珠菌血癥,感染后2d念珠菌血癥消失。免疫正常組小鼠感染后1d念珠菌血癥即消失。兩組小鼠在整個實驗期血清可檢出Eno、Fba,免疫正常組Eno陽性率為33.3%-100%,Fba陽性率為75%-100%,免疫抑制組Eno陽性率為50%-100%,Fba陽性率為100%,在每個觀察時間點Eno和Fba陽性率均高于同期血培養(yǎng)陽性率,免疫正常組小鼠感染后Id, Fba陽性率顯著高于血培養(yǎng)陽性率(P=0.008,P0.05/4),免疫抑制組小鼠感染后3d Eno陽性率、感染后2d、3d和5d Fba陽性率顯著高于血培養(yǎng)陽性率(P均=0.008,P0.05/4)。 5.2IC小鼠血清Eno和Fba水平 免疫正常組小鼠感染后8h、1d Fba水平[分別為4.56(3.66,34.03)ng/ml和23.76(20.34,41.06) ng/ml]顯著高于正常對照組[0(0,0.175) ng/ml](P均=0.008,P0.05/6)。免疫抑制組小鼠感染后1d、3d Eno水平[分別為6.34(0.92,12.45)ng/ml和3.09(1.26,6.48)ng/ml]顯著高于正常對照組[0(0,0) ng/ml](P均=0.005,P0.05/6),感染后所有時間點Fba水平均顯著高于正常對照組‘(P均=0.008,P0.05/6),差異具有統(tǒng)計學意義。免疫抑制組小鼠外周血Eno和Fba抗原水平高于免疫正常組小鼠,感染后3d,免疫抑制組小鼠Eno水平與免疫正常組之間差別具有統(tǒng)計學意義(P=0.045)。血清Eno和Fba水平之間呈顯著正相關(rs=0.363,P=0.018,n=42)。 5.3IC小鼠腎勻漿Eno和Fba水平 免疫正常組和免疫抑制組IC小鼠在感染后8h到5d,腎組織勻漿全部可以檢出Eno和Fba,反映了腎臟侵襲感染狀態(tài)；感染后8h及1d,免疫抑制組Eno含量[分別(262.99±92.18) ng/ml和(325.24±117.32) ng/ml]高于免疫正常組[分別(139.24±61.48)ng/ml和(133.82±80.15)ng/ml],差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.037和P=0.017)。兩組小鼠感染后腎勻漿Eno和Fba含量高于正常對照組,感染后各時間段,免疫抑制組小鼠腎組織勻漿Eno和Fba水平均顯著高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05或P0.01)；感染后5d免疫正常組小鼠腎組織勻漿Fba水平[(999.96±168.78) ng/ml]顯著高于正常對照組[(0.38±0.22)ng/ml](P0.01)。感染后各時間點間,兩組小鼠腎組織勻漿Eno和Fba水平沒有統(tǒng)計學差異。腎組織勻漿Eno和Fba水平之間呈顯著正相關(rs=0.623,P=0,n=50)。 6.IC病人血清Eno和Fba定量檢測 6.1IC病人血清Eno和Fba定量檢測 92例IC病人血清Eno水平為0(0,1.33)ng/ml,血清Fba水平為3.58(0,16.32)ng/ml,顯著高于與陰性對照組血清Eno和Fba水平[均為0(0,0)](U值分別3026.5和4312.0,P均=0)。白念珠菌感染患者(n=46)血清Eno和Fba水平最高[分別為0.52(0,3.55) ng/ml和5.53(0,31.31) ng/ml],其次為熱帶念珠菌感染組(11=17)[分別為0(0,0.39) ng/ml和3.67(0,19.81) ng/ml],再次為近平滑念珠感染組(n=15)[分別為0(0,0.23) ng/ml和0(0,4.69) ng/ml],其他念珠菌感染組(n=14)最低[分別為0(0,0) ng/ml和0(0,3.72)ng/m1]。其他念珠菌感染患者、陰性對照組Eno和Fba水平與白念珠菌感染患者之間差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05/5或P0.01/5),陰性對照組Fba水平與近平滑念珠菌感染患者、熱帶念珠菌感染患者之間差異具有顯著性(P0.05/5或P0.01/5)。Eno、Fba對侵襲性念珠菌感染診斷的敏感性分別為33.70%(31/92)和53.26%(49/92),兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。Eno在不同念珠菌侵襲感染病人中的陽性率均低于Fba,但兩者之間未見統(tǒng)計學差異。Spearman相關分析顯示,侵襲性念珠菌感染病人200份血樣中Eno和Fba水平之間呈顯著正相關(rs=0.489,P=0,n=200)。 6.2侵襲性白念珠菌感染病人血清Eno和Fba定量檢測 Eno檢測對侵襲性白念珠茵感染的敏感性為52.17%(24/46),對非白念珠菌侵襲感染的敏感性為13.04%(6/46),兩者之間差異具有極顯著性(x2=16.026,P=0)；Fba檢測對侵襲性白念珠菌感染的敏感性為69.57%(32/46),對非白念珠菌侵襲感染的敏感性為34.78%(16/46),前者顯著高于后者(x2=11.152,P=0.001)。Eno與Fba定量檢測對侵襲性白念珠菌感染的敏感性、特異性和AUC分別為52.17%、99.23%、0.729和69.57%、99.23%、0.839,兩者聯合檢測敏感性上升為80.43%。Eno與Fba定量檢測陽性結果可以早于血培養(yǎng)陽性結果。增加檢測頻次有助于提高IC的檢出率。 結論 1.利用單克隆抗體作為包被抗體,HRP標記的多克隆抗體作為檢測抗體,重組蛋白作為標準品,建立了定量檢測Eno和Fba的雙抗體夾心ELISA法。通過對性能指標的評價,定量檢測Eno和Fba雙抗體夾心ELISA方法的特異性、精密度、血清回收率均能滿足臨床應用的要求,檢測靈敏度與文獻報道較為一致。 2.建立的定量檢測雙抗體夾心ELISA方法可特異性檢出白念珠菌培養(yǎng)過程中產生的天然Eno和Fba,培養(yǎng)上清中的Eno和Fba水平與菌絲生長狀態(tài)呈正相關。Eno定量檢測與近平滑念珠菌,Fba定量檢測與熱帶念珠菌、近平滑念珠菌有微弱交叉反應。雙抗體夾心ELISA方法與光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新型隱球菌和釀酒酵母培養(yǎng)上清中Eno和Fba無交叉反應。 3.建立了IC感染的免疫正常組和免疫抑制組小鼠模型,首次獲得Eno和Fba在IC進程中的動力學資料。感染后8h到5d,兩組小鼠腎組織勻漿全部可以檢出Eno和Fba,反映了腎臟侵襲感染狀態(tài)；兩組小鼠在整個實驗期血清Eno和Fba陽性率均高于同期血培養(yǎng)陽性率。血清Eno和Fba水平之間、腎組織勻漿Eno和Fba水平之間呈顯著正相關。免疫抑制組小鼠血清、腎組織勻漿Eno和Fba水平高于免疫正常組小鼠,提示Eno和Fba可以作為侵襲性念珠菌感染的診斷標志物。 4.首次評價了Eno和Fba定量檢測對IC的診斷價值,發(fā)現Eno和Fba定量檢測對侵襲性白念珠菌感染病人的診斷價值高于念珠菌屬感染的IC病人。Eno與Fba定量檢測對侵襲性白念珠菌感染的敏感性和特異性分別為52.17%、99.23%和69.57%、99.23%,兩者聯合檢測敏感性上升為80.43%,證實Eno與Fba是有潛力的IC診斷標志物。Eno與Fba定量檢測陽性結果可以早于血培養(yǎng)陽性結果,可用于早期診斷侵襲性白念珠菌感染,是血培養(yǎng)方法的有益補充。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R519.3

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1 胡毓安;Eno、Fba定量檢測對侵襲性念珠菌病的診斷價值評估[D];南方醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：1757561