本文選題：發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒 + 動(dòng)物宿主　； 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：背景發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV),屬布尼亞病毒科白蛉病毒屬,是一種分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,基因組包括L、M和S三個(gè)片段。由SFTSV感染所致的疾病稱為發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS),臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、乏力、肌肉酸痛、全身不適、惡心和嘔吐等,嚴(yán)重者出現(xiàn)多器官衰竭甚至死亡。SFTS流行于東亞,包括中國、日本和韓國。SFTS的病死率高達(dá)30%,平均約12%。SFTSV經(jīng)蜱叮咬傳播,也可通過接觸病人血液和分泌物感染。蜱為吸血媒介,可被其吸食血液的動(dòng)物分布廣泛,但這些動(dòng)物,特別是小型哺乳動(dòng)物在SFTSV傳播過程中的作用尚不明確。SFTSV可能起源于中國中部淮陽山區(qū)域,但病毒在中國、日本和韓國的傳播路徑尚不清楚。目前針對該疾病,既無特效藥物,也無有效的疫苗可供使用,對患者主要采取廣譜抗病毒治療和對癥支持治療。針對危重患者,中和抗體治療將是行之有效的方法。SFTS流行特征的解析、傳播模式的探討及抗體藥物的研發(fā),對豐富SFTS的病原學(xué)知識、流行病學(xué)理論、疾病的預(yù)防控制和診斷治療具有重要意義。目的通過監(jiān)測、分析自然狀態(tài)下小型宿主動(dòng)物SFTSV感染狀況,探討其在SFTSV傳播過程中所起作用,為該病的預(yù)防控制提供理論依據(jù);通過對SFTSV全基因組進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,探討SFTSV起源及可能傳播路徑,為SFTS的流行趨勢預(yù)測提供重要線索;研究SFTSV人源單克隆抗體,為SFTS的特效治療提供科學(xué)依據(jù)。方法1.動(dòng)物標(biāo)本采集及檢測(1)2013年1月至8月,以山東省青島市黃島區(qū)膠南地區(qū)為調(diào)查點(diǎn),捕獲宿主動(dòng)物,并對宿主動(dòng)物進(jìn)行種屬鑒定,采集宿主動(dòng)物脾臟、肝臟和心臟血標(biāo)本。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測心臟血SFTSV總抗體。自宿主動(dòng)物脾臟提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversed transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及巢式PCR擴(kuò)增SFTSV M和S片段部分基因序列,并進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果運(yùn)用NCBI-BLAST與數(shù)據(jù)庫比對分析,判斷其是否為SFTSV序列,并將所得到的SFTSV序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得GenBank號碼。根據(jù)ELISA和PCR擴(kuò)增結(jié)果,分別計(jì)算宿主動(dòng)物SFTSV抗體陽性率和SFTSV帶毒率,并綜合抗體陽性率和宿主動(dòng)物帶毒率,計(jì)算宿主動(dòng)物感染率。(2)將所得序列與自NCBI獲得的參考株序列建立數(shù)據(jù)集,以Mega 5.0軟件Clustal W程序進(jìn)行比對,采用Neighbor-joining(NJ)法Kimura2-parameter distance模型,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹并進(jìn)行自展信度檢驗(yàn)。2.SFTSV遺傳進(jìn)化分析(1)從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫搜索并下載SFTSV病毒株序列信息,明確每株病毒標(biāo)本采集時(shí)間、地點(diǎn)。對病毒株的L、M和S片段序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,采用最大似然法(Maximum Likelihood Method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。(2)利用基因重組預(yù)測軟件 Recombination Detection Program version 3.44(RDP3)對病毒全基因組進(jìn)行初步預(yù)測,確定可能的基因重配株。結(jié)合L、M和S片段序列系統(tǒng)發(fā)育分析中病毒株的分布,確定基因重配株。(3)基于貝葉斯馬爾可夫鏈蒙特卡洛(Bayesian Markov chain Monte Carlo,MCMC)原理及分子鐘模型,運(yùn)用軟件BEASTv1.8.0對病毒株的L、M、S片段序列及全基因組序列進(jìn)行分析,確定病毒SFTSV的進(jìn)化速率、分化時(shí)間及最近共同祖先(the most recent common ancestor,TMRCA)出現(xiàn)的時(shí)間。為檢驗(yàn)病毒的進(jìn)化速率是否是隨機(jī)的,對序列信息進(jìn)行隨機(jī)化,用真實(shí)時(shí)間數(shù)據(jù)得出的進(jìn)化速率和隨機(jī)化的進(jìn)化速率進(jìn)行比較,從而確定病毒的進(jìn)化速率是否是隨機(jī)的�；诓《局嘏浜头只瘯r(shí)間對病毒傳播路徑進(jìn)行分析推測。3.SFTSV人源單克隆抗體制備及生物學(xué)功能研究(1)利用蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測軟件預(yù)測SFTSV糖蛋白跨膜序列,確定胞外區(qū)序列。構(gòu)建包含SFTSV糖蛋白Gn和Gc胞外區(qū)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒,并表達(dá)純化蛋白Gn、Gc。(2)從病人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)分選針對SFTSV糖蛋白的記憶B細(xì)胞。RT-PCR、PCR擴(kuò)增記憶B細(xì)胞中抗體可變區(qū)基因序列,重疊PCR法將抗體可變區(qū)與恒定區(qū)連接,構(gòu)成抗體輕、重鏈全序列。將抗體輕、重鏈全序列克隆入真核表達(dá)載體,構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒。將包含抗體輕、重鏈全序列的重組真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T,利用Western Blot初步篩選可以表達(dá)抗SFTSV Gn或Gc抗體的輕、重鏈質(zhì)粒組合。對初步篩選到的抗體,利用ELISA、間接免疫熒光和空斑減少中和試驗(yàn)進(jìn)一步研究抗體的蛋白結(jié)合活性、病毒結(jié)合活性和中和活性。結(jié)果1.捕獲動(dòng)物種屬構(gòu)成及感染狀況(1)2013年1～8月,在山東省青島市黃島區(qū)膠南地區(qū),共捕獲小型哺乳動(dòng)物774只,涵蓋2目3科5屬6種,包括褐家鼠(157只,20.3%)、小家鼠(183 只,23.6%)、大倉鼠(135 只,17.4%)、黑線姬鼠(188 只,24.3%)、黑線倉鼠(18只,2.3%)及，

本文編號：1736152