本文選題：肺炎支原體　切入點(diǎn)：四環(huán)素類　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：【目的】肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mp)是最常見的呼吸道感染病原菌之一,人群普遍易感。肺炎支原體是我國社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的首位致病菌[1,2],經(jīng)常出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)流行(平均每2-6年出現(xiàn)一次全球流行),近年來還出現(xiàn)越來越多的危重病例[3-5]。肺炎支原體的抗生素選擇方案主要有三大類:大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類。大環(huán)內(nèi)酯類作為首選抗生素,近年耐藥率不斷上升,我國以92%的耐藥率高居世界之首[6]。如何預(yù)防肺炎支原體對其他兩種抗生素產(chǎn)生耐藥性變得極其重要。從2001年Okazaki N等人第一次公開報道肺炎支原體對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥[7],到2009年我國出現(xiàn)92%耐藥率的報道,中間僅僅相隔了不到十年的時間。雖然還沒有肺炎支原體對喹諾酮臨床耐藥的報道,但在其他人類支原體中[8,9]已經(jīng)分離到喹諾酮類的臨床耐藥株,國內(nèi)外也都已有用喹諾酮類體外誘導(dǎo)肺炎支原體耐藥成功的報道[10,11]。加之喹諾酮類因?yàn)槠鋵趋腊l(fā)育的影響而禁用于18歲以下人群,四環(huán)素類成為8-18歲人群耐大環(huán)內(nèi)酯類肺炎支原體感染的唯一選擇。四環(huán)素目前在臨床與體外均未出現(xiàn)過耐藥的報道。本實(shí)驗(yàn)旨在收集臨床樣本,篩查臨床對四環(huán)素耐藥的肺炎支原體株,同時進(jìn)行體外誘導(dǎo)耐藥。通過對臨床與誘導(dǎo)耐藥兩者耐藥機(jī)制的探討,對臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo),避免或者延緩肺炎支原體對四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生耐藥�！痉椒ā�1.本課題組已在2010-2014年期間從某醫(yī)院呼吸科門診和病房從患者的呼吸道標(biāo)本中培養(yǎng)和分離獲得了數(shù)十株肺炎支原體株,建立了肺炎支原體菌株庫,本實(shí)驗(yàn)從該菌株庫中復(fù)蘇肺炎支原體株;用肺炎支原體肉湯培養(yǎng)法與肺炎支原體瓊脂培養(yǎng)法交替?zhèn)鞔垣@得純化的肺炎支原體菌株。同時繼續(xù)從臨床收集咽拭子、肺泡灌洗液等呼吸道標(biāo)本,用實(shí)時定量PCR與肉湯培養(yǎng)法繼續(xù)鑒定、分離、培養(yǎng)新的肺炎支原體株。2.用96孔板肉湯微量稀釋法對肺炎支原體進(jìn)行藥敏檢測,若肺炎支原體對四環(huán)素類MIC≥8μg/m L時,判斷為肺炎支原體對四環(huán)素類耐藥。3.對敏感株進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥,在含有低于抑菌濃度抗生素的培養(yǎng)基中逐代培養(yǎng),直至肺炎支原體株產(chǎn)生耐藥。4.對耐藥株進(jìn)行添加外排泵抑制劑利血平和碳酰氰基-對-氯苯腙(CCCP)的藥敏實(shí)驗(yàn),觀察外排泵抑制劑對MIC值的影響,排查耐藥株中是否存在外排泵。5.對耐藥株和敏感株進(jìn)行全基因測序,篩查耐藥株中是否含有核糖體保護(hù)蛋白基因、外排泵基因、滅活酶基因或其他耐藥基因,并進(jìn)行靶區(qū)(16S r RNA)序列的比對分析。6.核糖體與四環(huán)素結(jié)合力實(shí)驗(yàn):用同位素H(氚)標(biāo)記四環(huán)素,將同位素標(biāo)記的四環(huán)素分別與敏感株和誘導(dǎo)耐藥株(已驗(yàn)證16S r RNA靶位突變)的核糖體孵育結(jié)合,將孵育液濾過GF/C濾膜(Whatman),再用5 m L緩沖液洗膜3次,濾膜80℃烤干后置于1 m L閃爍液中過夜。使用液體閃爍計(jì)數(shù)儀(Tricarb 9100型,美國PE公司)測量CPM值(count per minute)。7.對敏感株與耐藥株進(jìn)行蛋白雙向電泳,通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,尋找敏感株與耐藥株間的差異蛋白,鑒定是否含有與四環(huán)素耐藥相關(guān)的功能蛋白�！窘Y(jié)果】1.共成功復(fù)蘇33株肺炎支原體株,共收集臨床樣本132份,實(shí)時定量PCR檢測肺炎支原體陽性樣本12份(9.1%),但未從臨床分離獲得新的肺炎支原體株。2.藥敏結(jié)果顯示肺炎支原體對四環(huán)素類全部敏感,其中替加環(huán)素MIC值相對較低,顯示出比一、二代四環(huán)素及喹諾酮類更好的抗菌活性,肺炎支原體對左氧氟沙星全部敏感,對紅霉素耐藥率54.8%。3.在含四環(huán)素類的培養(yǎng)基中持續(xù)傳代,共獲得8株對四環(huán)素類耐藥(MIC≥8μg/m L)的誘導(dǎo)耐藥株,所有經(jīng)歷過四環(huán)素類誘導(dǎo)的菌株,MIC值均較誘導(dǎo)前有顯著升高,并且對其他四環(huán)素有交叉耐藥。4.外排泵抑制劑利血平可以將部分菌株對四環(huán)素、米諾環(huán)素及替加環(huán)素的MIC值降低4倍以上,碳酰氰基-對-氯苯腙(CCCP)對耐藥株MIC值未發(fā)現(xiàn)明顯類似作用。5.全基因組測序提示8株誘導(dǎo)耐藥株中,6株存在16S r RNA 1173位點(diǎn)A→T突變;另外2株同時存在964位點(diǎn)T→C、1169位點(diǎn)G→A的點(diǎn)突變。所有的敏感株均未檢測到以上位點(diǎn)的改變。以上位點(diǎn)的突變僅出現(xiàn)在耐藥株中,且以上位點(diǎn)的突變位于四環(huán)素的結(jié)合靶區(qū)。另外,使用Res Finder2.1在全基因組序列中查找耐藥基因,在所有誘導(dǎo)耐藥株中均未發(fā)現(xiàn)核糖體保護(hù)蛋白基因、外排泵基因和滅活酶基因及其他與四環(huán)素耐藥相關(guān)的耐藥基因。6.靶位結(jié)合力實(shí)驗(yàn)顯示,誘導(dǎo)耐藥株的核糖體比敏感株核糖體對四環(huán)素的結(jié)合力明顯減低。7.建立了用蛋白雙向電泳對肺炎支原體蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的實(shí)驗(yàn)方法。在S63敏感株與誘導(dǎo)耐藥株中共選取19個差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定,鑒定結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與耐藥直接相關(guān)的功能蛋白。但發(fā)現(xiàn)在耐藥株中,與蛋白轉(zhuǎn)錄合成相關(guān)的蛋白(如分子伴侶蛋白、轉(zhuǎn)錄延長因子Gre A等)表達(dá)增多,在敏感株中,與能量代謝有關(guān)的蛋白(丙酮酸脫氫酶、烯醇酶等)表達(dá)增多�！窘Y(jié)論】1.本研究未發(fā)現(xiàn)臨床對四環(huán)素類耐藥的肺炎支原體;2.四環(huán)素類藥物可誘導(dǎo)肺炎支原體耐藥,且可呈交叉耐藥;3.首次獲得8株對四環(huán)素類耐藥的肺炎支原體的全基因序列并上傳Genbank;4.誘導(dǎo)耐藥株中尚未發(fā)現(xiàn)外排泵基因、核糖體保護(hù)基因和滅活酶基因;5.肺炎支原體對四環(huán)素類誘導(dǎo)耐藥最有可能的機(jī)制是靶區(qū)突變;6.靶位結(jié)合力實(shí)驗(yàn)提示16S rRNA靶區(qū)點(diǎn)突變可以降低核糖體對四環(huán)素的結(jié)合力;7.誘導(dǎo)耐藥株中未發(fā)現(xiàn)與四環(huán)素類耐藥直接相關(guān)的功能蛋白。
[Abstract]:Mycoplasma pneumoniae ( Mp ) is one of the most common pathogens in the respiratory tract infection , and the population is generally susceptible . The mycoplasma pneumoniae is the first pathogen of community acquired pneumonia ( CAP ) in our country . This experiment is aimed to collect clinical samples and to screen clinical drug - resistant strains of mycoplasma pneumoniae . The results showed that mycoplasma pneumoniae was sensitive to tetracycline ( MIC 鈮，

本文編號：1721187