本文選題：HIV-1疫苗　切入點(diǎn)：佐劑　出處：《中國(guó)疾病預(yù)防控制中心》2016年博士論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒-1型(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)發(fā)現(xiàn)至今已有三十多年,人們對(duì)其發(fā)病機(jī)理和免疫學(xué)特征也有了一定的認(rèn)識(shí),但制約HIV-1疫苗研發(fā)的主要科學(xué)和技術(shù)障礙仍未能跨越,有效阻止機(jī)體感染的疫苗尚未研發(fā)成功。HIV-1具有極高的遺傳多樣性,并且進(jìn)化出了許多機(jī)制來(lái)逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的攻擊。誘導(dǎo)持久的細(xì)胞免疫反應(yīng)和廣譜中和抗體是HIV-1疫苗發(fā)展的兩個(gè)重要目標(biāo)。細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持久性受外來(lái)免疫原和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)因子的影響。細(xì)胞因子Interleukin-21 (IL-21)作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子,其受體廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞表面,在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)時(shí)具有多重效應(yīng)性,因而,近年來(lái)IL-21被當(dāng)作調(diào)節(jié)疫苗免疫的佐劑廣泛應(yīng)用于疫苗的免疫策略中來(lái)提高機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。現(xiàn)今,部分HIV-1疫苗可以誘導(dǎo)出毒株特異性的中和抗體,但很難誘導(dǎo)出廣譜中和抗體,誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)也多不持久,這是阻礙HIV-1疫苗研究的技術(shù)瓶頸。在HIV-1自然感染者中,少部分(10%～25%)感染者中存在廣譜中和血清反應(yīng),機(jī)體能夠在和病毒的長(zhǎng)期斗爭(zhēng)中產(chǎn)生廣譜中和抗體。從這些感染者中尋找廣譜中和抗體,并深入研究其產(chǎn)生發(fā)展和成熟的過(guò)程,是一項(xiàng)重要的保護(hù)性體液免疫機(jī)制研究,其結(jié)果將有助于設(shè)計(jì)能誘導(dǎo)廣譜中和抗體的新型疫苗,同時(shí)也為治療提供了備選的免疫制劑。本論文研究針對(duì)以上HIV-1疫苗研究的兩個(gè)重要領(lǐng)域,展開(kāi)兩個(gè)方面的研究。一、細(xì)胞因子佐劑IL-21調(diào)節(jié)HIV-1疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究本研究系統(tǒng)評(píng)價(jià)了HIV-1 DNA疫苗初免-rTV/蛋白疫苗加強(qiáng)免疫策略在小鼠中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng),發(fā)現(xiàn)該免疫策略能夠誘導(dǎo)出廣泛持久的HIV-1特異性抗體反應(yīng)(IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)、特異性細(xì)胞因子的分泌(IFN-γ、IL-2和TNF-α)和多功能性T細(xì)胞。然后以此為基礎(chǔ),以細(xì)胞因子IL-21為佐劑與疫苗共免疫小鼠,觀察IL-21對(duì)疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)效應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-21能夠提高Thl型免疫反應(yīng)、顯著增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞和CD4+ TEM細(xì)胞分泌特異性IFN-γ和]TNF-α的能力,顯著提高多功能性CD4+T細(xì)胞和CD4+ TEM細(xì)胞的比例、顯著提高NK細(xì)胞的比例。二、HIV-1單克隆廣譜中和抗體的篩選及其進(jìn)化成熟機(jī)制研究本部分研究以本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的中國(guó)可產(chǎn)生廣譜中和抗體的H1V-1感染者為切入點(diǎn),分離出了多個(gè)中和寬度有限的HIV-1中和抗體,并對(duì)其中一個(gè)感染者2005年至2009年血液樣本進(jìn)行深入研究,系統(tǒng)分析了廣譜中和抗體的發(fā)生發(fā)展和成熟的過(guò)程。通過(guò)與TSRI (The Scripps Research Institute)科學(xué)家合作單細(xì)胞分選分離得到了產(chǎn)生抗HIV-1膜蛋白抗體的B細(xì)胞。采用單克隆抗體擴(kuò)增和表達(dá)技術(shù)獲得了單克隆抗體DRVIA7;特異性表位分析確定該抗體靶向CD4結(jié)合位點(diǎn)(CD4bs);經(jīng)Global和DRVI兩個(gè)中和測(cè)定盤(Global Panel, DRVI Panel)標(biāo)定,發(fā)現(xiàn)其具有抗HIV-1中和活性,但其中和寬度有限(33%,36%)�；蚍治霭l(fā)現(xiàn)其重鏈來(lái)源于IgHV1-02*02家系、體細(xì)胞突變率為19%,輕鏈來(lái)源于IgKV1-05*03、體細(xì)胞突變率為17%,可能為一種類VRC01中和抗體。合作單位TSRI科學(xué)家對(duì)該單克隆抗體的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,證實(shí)了DRVIA7為一種類VRC01抗體,將其與VRC01抗體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),DRVIA7抗體的輕鏈N端和LCDR1區(qū)與gp120上的V5區(qū)和N276關(guān)鍵糖位處存在結(jié)構(gòu)沖突,DRVIA7抗體與去糖基化gp120抗原的結(jié)合能力明顯提升,實(shí)驗(yàn)證實(shí)該結(jié)構(gòu)差異確實(shí)影響到了抗體的結(jié)合能力,解釋了該抗體中和寬度有限的可能原因。在上述結(jié)構(gòu)分析的指導(dǎo)下,我們通過(guò)基因改造刪掉DRVIA7輕鏈N端兩個(gè)氨基酸和替換VRC01 LCDR1區(qū),拓寬了DRVIA7抗體的中和寬度,也證實(shí)了糖位對(duì)抗體中和能力的影響。改造抗體在Global Panel和DRVI Panel上的中和寬度分別為100%和72%,能夠中和VRC01耐受的BJOX2000病毒。通過(guò)DRV1A7和VRC01抗體的輕重鏈交叉配對(duì)發(fā)現(xiàn)該抗體重鏈和輕鏈進(jìn)化成熟不一致,重鏈具備了較強(qiáng)的中和能力,當(dāng)與VRC01輕鏈配對(duì)時(shí),抗體中和寬度與VRC01相當(dāng)(Global Panel:100% vs. 92%, DRVI Panel:92% vs.96%),而且能夠中和4個(gè)VRC01耐受的病毒(BJOX2000, DU172,57128,3817),但是輕鏈未完全進(jìn)化,配對(duì)抗體的中和能力較弱。經(jīng)與TSRI科學(xué)家合作,開(kāi)展深度測(cè)序和生物信息學(xué)分析,對(duì)該感染者體內(nèi)抗體組學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)的研究,同時(shí)我們對(duì)挑選出的抗體基因進(jìn)行體外功能驗(yàn)證。分析發(fā)現(xiàn)DRVIA7-家系抗體基因在2006年之前開(kāi)始出現(xiàn),2008年達(dá)到高峰,2009年規(guī)模開(kāi)始衰退。對(duì)于重鏈基因而言,2006年挑選出的前體基因已經(jīng)具備了較強(qiáng)的中和能力(Global Panel:1.25 μg/ml,93%; DRVI Panel:0.84 μg/ml,86%),到2008年中和能力更強(qiáng)(Global Panel:0.92 μg/ml,90%; DRVI Panel:0.74 μg/ml, 92%),說(shuō)明重鏈基因可以在2年的時(shí)間內(nèi)快速成熟,2009年中和強(qiáng)度達(dá)到最高(Global Panel:0.54 μg/ml,98%; DRVI Panel:0.36 μg/ml,96%);對(duì)于輕鏈基因而言,2006年已經(jīng)具備了VRCOl-like LCDR3特征,但是在2009年抗體基因庫(kù)中僅發(fā)現(xiàn)一條具備較強(qiáng)中和能力的輕鏈(Global Panel:6.62 μg/ml,75%; DRVI Panel: 2.27 μg/ml,60%),說(shuō)明機(jī)體沒(méi)能完全跨越輕鏈成熟的障礙大量獲得更高強(qiáng)度的中和抗體,但同時(shí)也說(shuō)明了機(jī)體免疫系統(tǒng)確實(shí)也在通過(guò)進(jìn)化嘗試跨越這種障礙。通過(guò)感染者自身來(lái)源的輕重鏈配對(duì)獲得了中和能力更強(qiáng)的抗體(Global Panel: 83% vs.33%)也證實(shí)了這一點(diǎn),雖然配對(duì)抗體輕重鏈不一定來(lái)自同一個(gè)B細(xì)胞,但是說(shuō)明機(jī)體自身免疫系統(tǒng)有可能進(jìn)化出更強(qiáng)的廣譜中和抗體。綜上所述,本研究描述了細(xì)胞因子IL-21對(duì)HIV-1疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的增強(qiáng)效應(yīng),為其作為一種佐劑應(yīng)用于疫苗免疫提供了更多的臨床前數(shù)據(jù)支持。本研究首次從中國(guó)HIV-1感染者體內(nèi)分離得到了單克隆廣譜中和抗體,證實(shí)gp120上關(guān)鍵糖位阻礙了抗體輕鏈的成熟,闡明該分枝抗體的發(fā)展成熟過(guò)程,一方面得到了一系列廣譜中和能力強(qiáng)的單抗制劑,另一方面也為可誘導(dǎo)廣譜中和抗體疫苗的免疫原設(shè)計(jì)提供了理論支持和設(shè)計(jì)思路,在設(shè)計(jì)靶向該位點(diǎn)的疫苗時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮gp120上關(guān)鍵糖位,同時(shí)設(shè)計(jì)靶向激活該類抗體前體的疫苗可能誘導(dǎo)出廣譜中和抗體。本研究在一定程度上推進(jìn)了HIV-1疫苗在增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)和誘導(dǎo)廣譜中和抗體兩個(gè)重要方向上的發(fā)展。
[Abstract]:Human immunodeficiency virus - 1 ( HIV - 1 ) has been widely used in the immune response of HIV - 1 vaccine . A number of HIV - 1 neutralizing antibodies with limited width and width were isolated , and the blood samples from 2005 to 2009 were studied in this paper . The monoclonal antibody DRVIA7 was isolated and isolated by monoclonal antibody amplification and expression . The specific epitope analysis was used to determine the antibody - targeted CD4 binding site ( CD4bs ) . The results show that DRVIA7 - family antibody gene has structural conflict with VRC01 antibody . In addition , it has been proved that DRVIA7 - family antibody gene has structural conflict with VRC01 antibody . It has been proved that DRVIA7 - family antibody gene has structural conflict with VRC01 antibody . It has been proved that DRVIA7 - family antibody gene has a strong ability to bind to VRC01 . In 2009 , the antibody ( Global Panel : 6.62 渭g / ml , 98 % ; DRVI Panel : 0.36渭g / ml , 98 % ; DRVI Panel : 0.36渭g / ml , 96 % ) was found . For the first time , the monoclonal broad - spectrum neutralizing antibody is isolated from the HIV - 1 infected person in China . It is proved that the key sugar level in the immune system is a hindrance to the maturation of the light chain of the antibody . On the other hand , it provides theoretical support and design thinking for the immunogen design of the antibody vaccine . On the other hand , it can induce the broad spectrum neutralization antibody for the vaccine designed to target the antibody . This study promotes the development of the HIV - 1 vaccine in enhancing the cellular immune response and inducing the broad spectrum neutralization antibody .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.91

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