本文選題：結(jié)核分支桿菌　切入點(diǎn)：Rv2031c　出處：《石河子大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：結(jié)核�。∕ycobacterium，TB）是結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種人獸共患慢性傳染病，是由單一病原導(dǎo)致人類死亡的傳染性疾病之一，嚴(yán)重危害人類身心健康。結(jié)核分支桿菌可以入侵機(jī)體的各個(gè)器官，但主要以肺結(jié)核最為常見。結(jié)核分枝桿菌的主要宿主是人類和動(dòng)物，對(duì)人類而言，感染結(jié)核分枝桿菌后會(huì)引起咳嗽、發(fā)熱、咳血等臨床癥狀。MTB能在體內(nèi)潛伏感染并長(zhǎng)期存在，Rv2031c和Rv2626c是結(jié)核分枝桿菌潛伏期的兩個(gè)關(guān)鍵的分泌蛋白。本文從潛伏期的這兩個(gè)主要蛋白入手，構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，探討結(jié)核分枝桿菌潛伏期蛋白R(shí)v2031c和Rv2626c對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步研究其在胞內(nèi)生存機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 1.根據(jù)GenBank中公布的結(jié)核分枝桿菌的Rv2031c和Rv2626c各設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，以結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv基因組為模板，PCR擴(kuò)增Rv2031c和Rv2626c目的基因。將擴(kuò)增出的Rv2031c和Rv2626c基因片段克隆到pMD19-simple T載體，經(jīng)PCR挑選出陽性克隆菌、雙酶切和送公司測(cè)序鑒定。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并命名為pMD19-T-Rv2031c和pMD19-T-Rv2626c。分別將pMD19-T-Rv2031c和pMD19-T-Rv2626c質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XhoI/PstI和XhoI/SalI進(jìn)行雙酶切，回收Rv2031c和Rv2626c基因片段，然后分別與真核表達(dá)載體pEGFP-N1進(jìn)行連接，經(jīng)酶切和DNA測(cè)序鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-Rv2031c、pEGFP-N1-Rv2626c的正確性。成功構(gòu)建真核表達(dá)載體并命名pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFP-N1-Rv2626c。 2.使用無內(nèi)毒素大提質(zhì)粒試劑盒分別提取pEGFP-N1、pEGFP-N1-Rv2031和pEGFP-N1-Rv2626c質(zhì)粒。分別通過脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)將3組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24后用熒光倒置顯微鏡觀察有綠色熒光表達(dá)。然后，提取3組細(xì)胞的總蛋白，用Western Blot方法對(duì)細(xì)胞蛋白樣進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。Western Blot顯示和預(yù)期的融合蛋白R(shí)v2031c-EGFP、Rv2626c-EGFP分子量大小相同，均為43KDa的蛋白條帶。 3.使用凱基公司生產(chǎn)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-APC/7-ADD染色轉(zhuǎn)染3組質(zhì)粒的293T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)pEGFP-N1、pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFP-N1-Rv2626c3組細(xì)胞在24h和48h的細(xì)胞凋亡率。同時(shí)，，提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，使用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-8mRNA水平。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1、pEGFP-N1-Rv2031c和pEGFP-N1-Rv2626c質(zhì)粒的293T細(xì)胞后24h和48h時(shí)凋亡率分別為10％、21.8％、11.3％和13％、34.8％、15.8％。Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量在隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的增加相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，而Bax、Caspase-3和Caspase-8隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，相對(duì)表達(dá)量顯著上升，在48h達(dá)到最高。綜合分析發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌Rv2031c和Rv2626c促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步研究這兩個(gè)蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的影響以及結(jié)核桿菌在胞內(nèi)生存機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R52

【參考文獻(xiàn)】

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