本文選題：酸酐修飾　切入點(diǎn)：人血清白蛋白　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：自1981年第一例HIV/AIDS感染病例在美國(guó)被報(bào)道以來(lái),艾滋病迅速地在全世界范圍內(nèi)蔓延。理論上,HIV感染最好的預(yù)防手段是研發(fā)艾滋病疫苗。然而,目前仍沒(méi)有一個(gè)艾滋病疫苗被臨床試驗(yàn)證明為有效。目前,治療HIV主要手段是使用各種抗病毒藥物。目前臨床批準(zhǔn)的抗艾滋病藥物已經(jīng)有29種,但絕大部分針對(duì)病毒編碼的兩種酶,即逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶。盡管有這么多的抗HIV藥物,但它們?nèi)匀徊荒芮宄鼿IV,只能抑制病毒的復(fù)制,將病毒載量降低,定程度地恢復(fù)患者的免疫功能,延長(zhǎng)患者的生命。直到2003年,第一個(gè)HIV進(jìn)入抑制劑衍生于病毒包膜蛋白gp41的多肽恩夫韋特(T-20)被FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床,開(kāi)創(chuàng)了病毒進(jìn)入抑制劑作為抗病毒藥物的新時(shí)代。HIV進(jìn)入抑制劑雖然能從源頭上阻止病毒的入侵,但其僅能特異性地抑制HIV-1,對(duì)HIV-2沒(méi)有抑制活性,同時(shí)多肽類(lèi)藥物價(jià)格昂貴,也限制了它們的臨床應(yīng)用。另一棘手的問(wèn)題是HIV病毒變異性極高,極易產(chǎn)生耐藥株,從而使現(xiàn)有的許多抗病毒藥物失活。聯(lián)合3種或4種抗病毒藥物(通常包含一種蛋白酶抑制劑)的高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒聯(lián)合療法(Highly Active Anti-Retroviral Treatment, HAART)目前已成為治療HIV感染的標(biāo)準(zhǔn)方法,其可以顯著降低HIV感染患者的死亡率和發(fā)病率。HAART通常被稱(chēng)為“雞尾酒療法”(Cocktail therapy)。不同作用機(jī)制的抗病毒藥物之間的相互作用及合理搭配使HAART的效果比單一用藥有優(yōu)勢(shì),能有效地降低用藥劑量,減少不良反應(yīng),提高抗病毒譜,更為重要的是能減少耐藥病毒株的產(chǎn)生。因此,急需尋找新的來(lái)源的藥物抑制HIV的廣泛傳播。 人血清白蛋白(HSA)是人血漿中的最為主要的蛋白質(zhì),其具有許多重要的生理學(xué)和藥理學(xué)功能,目前已經(jīng)成為基礎(chǔ)及臨床研究最廣泛的目標(biāo)蛋白之一。尤其是對(duì)HSA進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾,利用化學(xué)修飾產(chǎn)物作為理想的治療分子進(jìn)行研發(fā),已經(jīng)成為生命科學(xué)中重要的研究手段之一。HSA其非糖基化的單鏈多肽包含585個(gè)氨基酸,相對(duì)分子量為66.5kD,主要是由18種氨基酸殘基組成,其中堿性氨基酸賴(lài)氨酸有59個(gè),精氨酸則有27個(gè)。由于酸酐是強(qiáng)酸性物質(zhì),而蛋白質(zhì)末端含有很多堿性的氨基酸,因此兩者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí),其蛋白質(zhì)末端的堿性氨基酸殘基必然會(huì)被酸酐所修飾。如果將蛋白末端的這些堿性氨基酸,選用適合的酸酐進(jìn)行化學(xué)修飾,將得到一類(lèi)新的物質(zhì),即酸酐修飾的HSA。1995年,美國(guó)紐約血液中心的Neurath AR和姜世勃等人的研究發(fā)現(xiàn)3-羥基-鄰苯二甲酸酐(3-hydroxyphthalic anhydride,3-HP)修飾的p-乳球蛋白((3-lactoglobulin,β-LG),即3-HP-β-LG,可特異性抑制HIV的感染。未經(jīng)修飾的β-乳球蛋白及3-HP本身都無(wú)抑制HIV的活性,說(shuō)明酸酐修飾使無(wú)活性的蛋白產(chǎn)生了抗HIV活性。然而由于時(shí)逢全球瘋牛病爆發(fā),使得來(lái)源于牛奶蛋白的制劑3HP-β-LG的研發(fā)受到了極大的影響,將其研發(fā)的試驗(yàn)研究被迫終止。 HSA是人血液中最為主要的一種蛋白質(zhì),其含量占血漿中總蛋白含量的60%以上,因此含量豐富。而且結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定,在人血管和血管外循環(huán)中分布較廣,半衰期長(zhǎng)達(dá)19d,無(wú)明顯的免疫原性,是血液中重要的物質(zhì)輸送載體,因此將其做為抗病毒藥物研發(fā)具有一定的優(yōu)勢(shì)。因此,本文采用類(lèi)似的方法,選用人血清白蛋白作為被修飾蛋白,來(lái)研究酸酐修飾人血清白蛋白特性和評(píng)價(jià)其抗病毒活性及其可能的臨床應(yīng)用。 1.酸酐修飾人血清白蛋白HP-HSA的制備和條件優(yōu)化 本文參考文獻(xiàn)方法,選用3-羥基-鄰苯二甲酸酐HP來(lái)修飾人血清白蛋白HSA,為優(yōu)化HP-HSA的制備條件,我們選用不同濃度的HP (20mM、40mM及60mM)和不同的pH值反應(yīng)體系(pH7.0、8.0及9.0),合成了的一系列不同的HP-HSA,并評(píng)價(jià)這些HP-HSA的抗兩種HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株(X4及R5型)的活性。同時(shí),我們還通過(guò)檢測(cè)不同條件下合成的HP-HSA期蛋白末端堿性氨基酸(主要包括賴(lài)氨酸及精氨酸)殘基被HP修飾比率,比較HP-HSA的抗病毒活性與蛋白末端堿性氨基酸被修飾比率之間的相關(guān)性。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),HSA蛋白末端的堿性氨基酸殘基大部分能被HP所修飾,其蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,從而將無(wú)活性的HSA轉(zhuǎn)變成具有較強(qiáng)抗HIV-1活性的病毒抑制劑HP-HSA。HP-HSA中賴(lài)氨酸和精氨酸殘基的被修飾的比率越高,其抗抗HIV-1X4型(HIV-1ⅢB)及R5型(HIV-1Bal)的病毒株的作用也相應(yīng)的越強(qiáng),說(shuō)明蛋白末端堿性氨基酸被修飾的比率與HP-HSA抗病毒活性密切呈正相關(guān),修飾蛋白末端的堿性氨基酸殘基被相應(yīng)酸酐修飾的比率與酸酐修飾蛋白的抗病毒活性密切相關(guān)。通過(guò)比較分析確定,HP-HSA化學(xué)修飾的最優(yōu)合成條件為,酸酐HP終濃度60mM,pH值為9.0,在這一條件下,HP-HSA的蛋白末端賴(lài)氨酸被修飾的比率為98.17%,而精氨酸被修飾的比率為91.67%。而在這一條件下,合成的HP-HSA的抗HIV-1IIIB(X4型)和BaL(R5型)病毒的IC50值分別是0.851nM和1.454nM。 2. HP-HSA抗病毒活性研究 作為一個(gè)理想的防治性傳播性疾病的抗病毒制劑,首先要保證其具有廣譜性和有效性,即能夠高效抑制絕大部分與性傳播疾病有關(guān)的病原體的感染。與3HP-β-LG相類(lèi)似,酸酐修飾蛋白HP-HSA也具有廣譜高效的抗病毒活性,其能抑制多種HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒株包括HIV-1X4型和R5型,IC50在低納摩爾水平。 另外,HP-HSA也能有效抑制HIV-2感染,意味著HP-HSA也能被用于HIV-2病毒廣泛流行的西非等國(guó)家。同時(shí)HP-HSA還能抑制SIV的感染[4]。由于SIV病毒能夠感染恒河猴,因此利用SIV病毒陰道攻擊恒河猴的動(dòng)物模型,可先期評(píng)價(jià)HP-HSA在動(dòng)物體內(nèi)的抗病毒活性。 目前大多數(shù)的抗病毒藥物,尤其是臨床上應(yīng)用最為廣泛的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑臨床應(yīng)用的局限性最主要的是由于HIV病毒耐藥株的產(chǎn)生。HIV病毒需寄生于宿主細(xì)胞內(nèi),利用宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)生存、增殖,并保持極強(qiáng)的生命力。HIV病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)不斷復(fù)制,但是其復(fù)制的錯(cuò)配率極高且極易產(chǎn)生高變異性,這也是目前理想抗HIV病毒藥物研發(fā)緩慢的主要原因之一。本文研究發(fā)現(xiàn),HP-HSA對(duì)幾類(lèi)常見(jiàn)的抗病毒藥物包括核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT,非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑A17及HIV進(jìn)入抑制劑T20的耐藥病毒株,均具有非常好的抑制作用,其IC50值均在低納摩爾水平,與抗HIV-1實(shí)驗(yàn)室病毒分離株的抗性相當(dāng)。這彌補(bǔ)了這些目前臨床應(yīng)用的主要的抗病毒藥物的不足,從而使其具備了被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的前景。如果將這類(lèi)蛋白類(lèi)藥物與抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用,可能也將成為抗病毒藥物研究的一個(gè)新的方向。 如前所述,生殖器單純皰疹病毒II型(Herpes Simplex Virus, HSV-2)是另一類(lèi)導(dǎo)致性傳播性疾病STD的主要病原體,約75%生殖器皰疹病例是由HSV-2引起的,它是引發(fā)生殖器皰疹和潰瘍最主要的原因,是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。值得注意的是,其引發(fā)的生殖器皰疹據(jù)報(bào)道與HIV感染的關(guān)系極為密切,研究發(fā)現(xiàn)患有生殖器皰疹的病人更容易感染HIV,其HIV感染率可增加2-4倍。因此,有效控制HSV-2感染對(duì)減少HIV的流行具有直接的作用。如果抗病毒藥物在具有抗HIV活性的同時(shí),具有抑制HSV-2病毒的作用,則將大大增加該抗病毒藥物的抗HIV活性,從而成為高效雙功能的抗病毒制劑。目前,臨床應(yīng)用的大部分抗HIV藥物均為窄譜抗病毒藥物,其無(wú)或者對(duì)HSV-2的抑制作用不強(qiáng)。本文我們研究發(fā)現(xiàn),酸酐修飾人血清白蛋白HP-HSA對(duì)HSV-2病毒有明顯抑制作用。 3. HP-HSA抗病毒作用機(jī)制研究 HIV病毒進(jìn)入CD+4靶細(xì)胞一般是在1h內(nèi)完成的。如果一種藥物為HIV進(jìn)入抑制劑,其必須在病毒進(jìn)入靶細(xì)胞前與病毒或靶細(xì)胞接觸。因此,我們選用time-of-addition的分析方式,在病毒感染靶細(xì)胞的不同階段加入酸酐修飾蛋白,以觀察HP-HSA到底作用在HIV感染的哪個(gè)環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)HP-HSA在病毒感染2h后加入時(shí),其抗HIV-lHIB和抗HIV-1BaL病毒活性完全消失,其作用與FDA批準(zhǔn)的三種HIV進(jìn)入抑制劑如T20,AMD3100(CXCR4輔助受體抑制劑)及Maraviric (CCR5輔助受體抑制劑)藥物的失活時(shí)間相似,而對(duì)照藥物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT,即使在病毒感染靶細(xì)胞8h后加入,仍然能保持較高的抗HIV-1活性。這些結(jié)果說(shuō)明HP-HSA是一類(lèi)特異性的HIV進(jìn)入抑制劑,對(duì)HIV病毒復(fù)制的其他環(huán)節(jié)無(wú)明顯作用。 由于阻斷HIV病毒生命周期的第一個(gè)階段,因此靶向HIV進(jìn)入階段的抗病毒藥物均具有明顯的優(yōu)勢(shì)。研究表明,游離病毒和已感染HIV的靶細(xì)胞都能感染新的靶細(xì)胞,而后者在HIV的感染中占主要地位。在HIV的感染過(guò)程中,首先是HIV包膜與靶細(xì)胞膜發(fā)生融合,HIV基因組進(jìn)入靶細(xì)胞。HIV進(jìn)入靶細(xì)胞是由病毒表面的包膜糖蛋白介導(dǎo)的。因此,阻止HIV病毒的進(jìn)入,關(guān)鍵是阻止HIV Env誘導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合及病毒-細(xì)胞融合過(guò)程。通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞融合、病毒-細(xì)胞融合及細(xì)胞間的傳播等實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知,HP-HSA的確作用于病毒的進(jìn)入階段,是一類(lèi)HIV進(jìn)入／融合抑制劑。 HIV通過(guò)三個(gè)步驟進(jìn)入宿主細(xì)胞：1)HIV顆粒通過(guò)其包膜上的糖蛋白gp120與靶細(xì)胞表面的CD4受體粘附；2)gp120發(fā)生構(gòu)象改變以適應(yīng)與靶細(xì)胞上的輔助受體CCR5或CXCR4結(jié)合；3)HIV跨膜蛋白亞基gp41介導(dǎo)病毒包膜與靶細(xì)胞膜發(fā)生融合。那么HP-HSA到底作用于HIV進(jìn)入的哪個(gè)環(huán)節(jié),則成了我們下一步關(guān)心的問(wèn)題,因此我們對(duì)HP-HSA的作用靶點(diǎn)進(jìn)行研究。 HIV進(jìn)入靶細(xì)胞的第一步就是HIV病毒顆粒通過(guò)其包膜糖蛋白gp120與靶細(xì)胞表面的CD4受體粘附,因此,我們首先檢測(cè)HP-HSA是否抑制gp120和可溶性CD4分子(sCD4)的體外結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HP-HSA能抑制來(lái)源于HIV-1HIB和HIV-1BaL的gp120與sCD4的結(jié)合,而未修飾HSA則無(wú)抑制作用。這些結(jié)果表明,HP-HSA可能是通過(guò)抑制病毒包膜糖蛋白gp120結(jié)合到靶細(xì)胞上的CD4受體而產(chǎn)生抑制作用的。ELISA和流式分析結(jié)果進(jìn)一步表明,HP-HSA可通過(guò)與病毒包膜糖蛋白gp120和靶細(xì)胞上的CD4受體結(jié)合,阻止HIV-1的gp120與CD4兩者的相互作用,從而產(chǎn)生抑制病毒與細(xì)胞膜融合的過(guò)程。HSA蛋白表面正電荷的精氨酸和賴(lài)氨酸殘基被酸酐修飾之后,其表面聚集著大量的負(fù)電荷側(cè)鏈,這些負(fù)電荷側(cè)鏈能與gp120和CD4分子結(jié)合,從而產(chǎn)生抗病毒作用。 4. HP-HSA的局部用藥安全性研究 理想的抗病毒藥物除了具備上述價(jià)廉和高效等條件外,更為重要的一點(diǎn)即為其安全性�？共《舅幬镉捎诳赡苊咳毡欢啻问褂�,且長(zhǎng)期甚至終生服用,因此必須不會(huì)導(dǎo)致組織損傷,不會(huì)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),不會(huì)改變陰道內(nèi)酸性環(huán)境,不會(huì)造成陰道內(nèi)菌群失調(diào),同時(shí),應(yīng)無(wú)全身性毒副反應(yīng)。在體液中仍能保持較好的抗病毒活性。 陰道粘膜是多層鱗狀上皮細(xì)胞,它們組成了防御外來(lái)病毒的一道物理屏障。因此,任何能破壞上皮組織完整性的因素,譬如物理?yè)p傷、性傳播病原體的感染、局部潰瘍及炎癥、激素水平失衡、陰道正常菌群失調(diào)、以及不當(dāng)使用陰道洗液等,都可能提高HIV的感染率。因此,藥物對(duì)陰道上皮細(xì)胞的毒性是其能否用于臨床的關(guān)鍵。我們首先評(píng)價(jià)了HP-HSA對(duì)3種T淋巴細(xì)胞和3種正常人陰道及子宮頸上皮細(xì)胞的體外毒性,結(jié)果顯示,HP-HSA對(duì)測(cè)試的6種病毒作用T淋巴靶細(xì)胞及正常人陰道及子宮頸組織細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用很低,其CC50的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其抑制HIV-1HIB病毒的IC50值,這意味著HP-HSA體外基本無(wú)毒。 陰道乳酸菌是內(nèi)源性的殺微生物劑,它能通過(guò)產(chǎn)生乳酸和過(guò)氧化氫來(lái)發(fā)揮效能。流行病學(xué)研究表明產(chǎn)過(guò)氧化氫乳酸菌能有效降低HIV的感染率。其原因推測(cè)是間接的,產(chǎn)過(guò)氧化氫乳酸菌能降低細(xì)菌性陰道炎的發(fā)病率,而后者導(dǎo)致的陰道上皮組織損傷是HIV傳染的一個(gè)主要影響因素。因此,我們?cè)u(píng)估了HP-HSA對(duì)17株正常人陰道乳酸桿菌生長(zhǎng)的影響。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),較高濃度的HP-HSA對(duì)陰道正常乳酸桿菌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響,而陽(yáng)性對(duì)照藥物氨芐青霉素對(duì)陰道乳酸桿菌各株均有明顯抑制作用,其MIC為0.313～1.25 前面研究證實(shí),HP-HSA的作用靶點(diǎn)之一為T(mén)淋巴細(xì)胞表面的CD4受體,而CD4+T淋巴細(xì)胞是人免疫系統(tǒng)中極為重要的一類(lèi)細(xì)胞,對(duì)人正常免疫功能起著至關(guān)重要的作用[8]。那么,HP-HSA作為殺微生物劑用于機(jī)體后,是否會(huì)對(duì)T淋巴細(xì)胞的正常的功能產(chǎn)生影響?首先,我們觀察了HP-HSA是否對(duì)正常人PBMCs增殖的影響,同時(shí)觀察了HP-HSA對(duì)PHA刺激的PBMCs增殖的反應(yīng),結(jié)果證明即使在濃度為100μM時(shí),HP-HSA對(duì)正常和PHA刺激的PBMCs的生長(zhǎng)增殖均無(wú)明顯的影響。隨后,我們?cè)u(píng)估了HP-HSA對(duì)正常和PHA刺激的PBMCs分泌細(xì)胞因子IFN-γ功能的影響,結(jié)果同樣證明HP-HSA對(duì)正常和PHA刺激PBMCs的免疫功能無(wú)影響。這些結(jié)果初步證明,HP-HSA對(duì)CD4+T細(xì)胞的功能,尤其是處于體內(nèi)循環(huán)狀態(tài)的T細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生有害的影響。但是,我們也不能排除長(zhǎng)期應(yīng)用阻斷CD4受體的殺微生物劑可能會(huì)抑制陰道粘膜中的CD4+T細(xì)胞的免疫功能,這也正是我們下一步準(zhǔn)備進(jìn)行的安全性實(shí)驗(yàn),評(píng)估HP-HSA對(duì)家兔陰道粘膜免疫系統(tǒng)的影響。 性傳播是目前HIV傳播的主要途徑,因此人體精液和宮頸陰道液對(duì)抗HIV藥物活性影響的評(píng)估就顯得至關(guān)重要了。一般來(lái)說(shuō),理想的抗病毒藥物還應(yīng)該在存在大量體液時(shí),仍能保持較強(qiáng)的抗病毒活性。有文獻(xiàn)報(bào)道,精液的存在會(huì)降低一些候選殺微生物劑的活性。本文結(jié)果可見(jiàn),人體正常精液和陰道模擬液對(duì)HP-HSA的抗病毒活性并無(wú)顯著影響。(五)小結(jié) HP-HSA為水溶性蛋白,其無(wú)味,高濃度是呈淡黃色,制備簡(jiǎn)單、快速、可重現(xiàn),且其體外毒性、免疫功能和穩(wěn)定性評(píng)估證明其安全穩(wěn)定,具有被開(kāi)發(fā)成抗病毒藥物的潛能。HP-HSA的優(yōu)勢(shì)：1)具廣譜抗病毒活性,能對(duì)抗HIV-1,HIV-2, SIV和HSV的感染；2)能有效對(duì)抗各類(lèi)藥物的耐受株,包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥株、非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑耐藥株及T20耐藥株；3)HP-HSA為來(lái)源于人的大分子蛋白類(lèi)藥物,其生物半衰期長(zhǎng)；4)HSA來(lái)源于人類(lèi),其抗原性較低,不易誘導(dǎo)不利的免疫反應(yīng)。然而,HP-HSA作為蛋白類(lèi)藥物可能存在價(jià)格較高、給藥方式較難選擇等缺陷。將兩類(lèi)不同作用機(jī)制或不同作用靶點(diǎn)的新型抗病毒藥物與臨床應(yīng)用的抗病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用,將有效避免各自的優(yōu)缺點(diǎn),取長(zhǎng)補(bǔ)短,發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì),從而產(chǎn)生協(xié)同作用效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R512.91;R3411

【參考文獻(xiàn)】

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1 馬瑜;孟紅;;單純皰疹病毒侵入相關(guān)糖蛋白的研究進(jìn)展[J];國(guó)際病毒學(xué)雜志;2006年03期

2 李珉珉;李琳;姜世勃;張嘉杰;;基于細(xì)胞-細(xì)胞融合的HIV進(jìn)入抑制劑非感染性篩選方法的研究[J];暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

3 雷漾;鄭和義;;產(chǎn)H_2O_2的乳酸桿菌在性傳播疾病中的作用[J];中國(guó)艾滋病性病;2007年02期

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