本文選題：流感病毒　切入點(diǎn)：趨化因子　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：流感是危害人類健康的重要呼吸道傳染病,曾多次引起全球暴發(fā)流行,奪走數(shù)千萬人生命。流感病毒感染容易造成急性肺損傷(acute lung injury,ALI),嚴(yán)重者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome,ARDS),最終導(dǎo)致死亡。研究表明,急性肺損傷的產(chǎn)生,一方面是由于病毒本身,另一方面是由于感染引起的過度免疫反應(yīng)導(dǎo)致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”(cytokine storm)。隨著研究的深入,許多和流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷密切相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子被發(fā)現(xiàn),但其功能一直存在爭議,并且在禽流感病毒感染中報道甚少,特別是H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷,至今未見報道。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展和廣泛應(yīng)用,越來越多的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)被發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識,其在生命活動中發(fā)揮著重要作用,如腫瘤的發(fā)生發(fā)展、個體發(fā)育、神經(jīng)科學(xué)等。在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中,雖也有少數(shù)有功能的lnc RNA被發(fā)現(xiàn),但仍存在著大量功能未知的lnc RNA,特別是中性粒細(xì)胞lnc RNA表達(dá)譜,至今未見報道。我們設(shè)想找到一條lnc RNA,可在抗病毒天然免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用�；谝陨涎芯勘尘�,我們擬從趨化因子和長鏈非編碼RNA功能和機(jī)制為切入點(diǎn),分別從蛋白水平和RNA水平,探討天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒感染導(dǎo)致的急性肺損傷中的作用,開展以下兩部分研究:一、趨化因子CCL2在甲型H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用研究為了建立甲型H7N9禽流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷的小鼠模型,我們首先利用H7N9禽流感毒株(Ah01株和Hb01株)感染C57BL/6小鼠,從小鼠體重變化和死亡率結(jié)果來評價感染效果,結(jié)果顯示Hb01株毒力較Ah01株強(qiáng),能夠使小鼠體重顯著下降,并快速誘導(dǎo)小鼠死亡。我們進(jìn)一步分析了小鼠肺部病理改變和肺部水腫程度,發(fā)現(xiàn)Hb01株H7N9禽流感病毒能夠有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生急性肺損傷,因此我們選擇Hb01株H7N9禽流感病毒感染小鼠模型為后續(xù)研究模型。在建模過程中,我們發(fā)現(xiàn)H7N9感染后小鼠的死亡高峰基本在一周出現(xiàn),與文獻(xiàn)報道的H5N1感染后小鼠死亡情況相似,這提示天然免疫同樣在H7N9感染導(dǎo)致小鼠死亡的過程中發(fā)揮著重要作用。利用獲得性免疫缺陷小鼠(Rag1-/-小鼠)感染H7N9模型,結(jié)果顯示Rag1-/-小鼠感染H7N9后表現(xiàn)出和野生型幾乎相同的死亡率、體重變化以及肺部病理變化,這進(jìn)一步表明H7N9感染導(dǎo)致小鼠主要在天然免疫階段。為了研究H7N9感染后小鼠的高細(xì)胞因子血癥,我們收集了H7N9感染后第5天小鼠的血清和支氣管肺泡灌洗液,進(jìn)行細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)譜分析,結(jié)果顯示大部分炎性細(xì)胞因子和趨化因子在感染后都有一定程度的升高,其中單核/巨噬細(xì)胞最重要的趨化因子CCL2在小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中都明顯升高,且維持在較高水平�？紤]到CCL2的作用及其表達(dá)水平,提示CCL2可能在H7N9感染導(dǎo)致的急性肺損傷中起到關(guān)鍵的作用。我們進(jìn)一步檢測了H7N9感染后小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中CCL2的動態(tài)變化,結(jié)果顯示小鼠感染H7N9后,CCL2從第1天開始便出現(xiàn)明顯的上升,其中在支氣管肺泡灌洗液中,CCL2的表達(dá)于第7天達(dá)峰,第9天開始回落;而在血清中一直呈高表達(dá)水平。通過共聚焦實驗,我們也發(fā)現(xiàn)H7N9感染的小鼠肺組織中有大量的CCL2表達(dá),進(jìn)一步提示了CCL2具有重要的作用。最后,為了明確CCL2在H7N9感染介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用,我們通過CCL2基因敲除小鼠感染H7N9發(fā)現(xiàn),CCL2基因敲除后,小鼠的死亡率明顯降低,體重下降減緩,且小鼠肺水腫情況明顯改善,肺損傷得到緩解。同時,我們發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后,支氣管肺泡中的中性粒細(xì)胞募集顯著增加,相反的,單核/巨噬細(xì)胞的募集卻被抑制了。病毒復(fù)制實驗顯示CCL2基因敲除后不能影響H7N9在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。綜上所述,我們首次建立了H7N9感染小鼠致死模型,分析獲得了小鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)譜,明確了CCL2表達(dá)的動態(tài)變化,且發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可有效緩解H7N9感染導(dǎo)致的急性肺損傷。我們在進(jìn)一步實驗中發(fā)現(xiàn)CCL2基因敲除后可抑制支氣管肺泡中單核/巨噬細(xì)胞的募集,增強(qiáng)中性粒細(xì)胞募集。這些結(jié)果提示我們中性粒細(xì)胞在H7N9感染介導(dǎo)的急性肺損傷過程中可能起到關(guān)鍵作用,啟發(fā)了我們的下一部分工作,同時也為趨化因子在H7N9禽流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷過程中的研究提供了依據(jù)。二、長鏈非編碼RNA AVAN在天然免疫抗流感病毒中的作用機(jī)制研究為了研究lnc RNA在天然免疫抗流感病毒中的作用,我們首先利用二代測序檢測了流感病毒感染患者危急重期與其恢復(fù)期的外周血中性粒細(xì)胞中l(wèi)nc RNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)了全新的差異表達(dá)的lnc RNA共有433條;經(jīng)過篩選進(jìn)一步確定了一條全新的lnc RNA在病毒感染后顯著高表達(dá),我們將其命名為AVAN(anti-virus and activate neutrophils,AVAN)。我們又利用NB和RACE實驗,發(fā)現(xiàn)AVAN只有一個轉(zhuǎn)錄本,長度為517核苷酸,通過核質(zhì)分離和RNA-FISH實驗發(fā)現(xiàn)AVAN均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。通過檢測AVAN在病毒感染后的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其表達(dá)具有一定的劑量依賴和時間依賴。在此基礎(chǔ)上,我們又開展了AVAN功能研究。首先分析了測序結(jié)果中和AVAN表達(dá)相關(guān)的m RNA,發(fā)現(xiàn)這些m RNA主要和流感病毒復(fù)制以及天然免疫激活相關(guān)。功能獲得和缺失實驗表明AVAN能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá),抑制流感病毒復(fù)制;同時,我們也發(fā)現(xiàn)AVAN能夠有效地激活中性粒細(xì)胞,增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化性。為了探究AVAN發(fā)揮抗病毒和增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性的具體分子機(jī)制,我們首先利用RNA pull down技術(shù),對差異富集的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)AVAN相對于其反義對照序列能夠有效地富集E3泛素連接酶TRIM25;用免疫印跡和RIP實驗進(jìn)一步驗證AVAN和TRIM25確有直接相互作用。同時,利用IP等實驗,發(fā)現(xiàn)AVAN可增強(qiáng)TRIM25與RIG-I相互作用,促進(jìn)RIG-I的泛素化,從而激活了RIG-I信號通路,誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá),抑制流感病毒復(fù)制�？紤]到AVAN同TRIM25相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì),而AVAN在細(xì)胞核內(nèi)也有大量分布。根據(jù)lnc RNA的作用方式,我們推測AVAN可能會通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾,進(jìn)而影響其他基因的表達(dá)發(fā)揮功能�；蚪M定位分析可見,AVAN位于6號染色體,在轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a啟動子區(qū)的反義鏈上。我們構(gòu)建了FOXO3a啟動子區(qū)的雙螢光素酶報告載體,發(fā)現(xiàn)AVAN能夠增強(qiáng)其螢光素酶活性,我們進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都驗證了AVAN能夠明顯地促進(jìn)FOXO3a的表達(dá)。為了明確AVAN是否能夠與FOXO3a的啟動子區(qū)直接結(jié)合,我們利用Ch IRP實驗,發(fā)現(xiàn)AVAN能夠直接結(jié)合到FOXO3a啟動子區(qū)(-600到-1000nt區(qū)域)。利用Ch IP實驗,我們發(fā)現(xiàn)AVAN能夠影響FOXO3a啟動子區(qū)(-600到-1000nt區(qū)域)H3K4me3和H3K27ac兩種組蛋白修飾,以及該區(qū)域RNA聚合酶II的結(jié)合。以上實驗結(jié)果表明AVAN能夠通過反式作用方式來促進(jìn)FOXO3a的表達(dá)。為了進(jìn)一步全面地了解AVAN對病毒感染后轉(zhuǎn)錄組的變化,我們用流感病毒感染AVAN過表達(dá)的細(xì)胞,利用m RNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)AVAN上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在I型干擾素通路以及細(xì)胞因子分泌通路。這進(jìn)一步證實了我們前面所發(fā)現(xiàn)的AVAN能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)和中性粒細(xì)胞活化的結(jié)果。最后,我們利用腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus,AAV)載體在C57BL/6小鼠體內(nèi)過表達(dá)AVAN,然后利用流感病毒感染小鼠,分別從體重變化、死亡率、肺臟的病理改變、水腫程度以及病毒滴度等方面觀察AVAN在小鼠體內(nèi)的作用。我們發(fā)現(xiàn)AVAN過表達(dá)后,流感病毒介導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的程度明顯得到了緩解,而且肺臟中病毒滴度也有明顯的下降。這證明在流感病毒感染時,AVAN能夠有效地保護(hù)小鼠。綜上所述,我們首次獲得了流感病人外周血中性粒細(xì)胞lnc RNA表達(dá)譜;篩選獲得了一條全新的lnc RNA AVAN,并對其做了全面的注釋和認(rèn)識。通過功能實驗發(fā)現(xiàn)AVAN能夠促進(jìn)I型干擾素的表達(dá)而抑制流感病毒復(fù)制,同時AVAN還能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞激活,增強(qiáng)其趨化性。在分子機(jī)制上,AVAN能夠在細(xì)胞質(zhì)中通過與TRIM25相互作用,影響RIG-I信號通路的激活;在細(xì)胞核中,AVAN能夠通過反式作用方式促進(jìn)FOXO3a的表達(dá),增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的活性。在體內(nèi)實驗中,我們證實AVAN能夠有效緩解流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷。此研究為將來篩選新型抗流感病毒RNA藥物提供了依據(jù)�？傊�,通過以上兩部分實驗,研究了天然免疫反應(yīng)在甲型流感病毒介導(dǎo)的急性肺損傷中的作用,探索了lnc RNA在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)的作用及機(jī)制,建立了一整套天然免疫抗病毒研究體系,為今后進(jìn)一步研究其他呼吸道病毒及新發(fā)突發(fā)傳染病奠定了基礎(chǔ)。我們發(fā)現(xiàn)趨化因子CCL2是甲型H7N9禽流感病毒感染導(dǎo)致急性肺損傷的重要因素,同時也鑒定出一條全新的lnc RNA AVAN在調(diào)節(jié)天然免疫抗流感病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,為將來篩選新型抗病毒藥物提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R511.7

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本文編號：1654329