發(fā)布時間：2018-03-18 16:14

  本文選題：核糖體蛋白S29　切入點：抗藥性　出處：《南京醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分核糖體蛋白S29(RPS29)參與蚊抗藥性機制研究 蚊媒病是全球重要的人類傳染病。蚊媒控制一直是蚊媒病防治的重要手段。化學防制是蚊媒控制的有效方法。然而長期大量地使用殺蟲劑,導致蚊媒抗藥性的發(fā)生和發(fā)展,蚊媒病防治效果不斷下降�？顾幮砸呀�(jīng)成為蚊媒病防治中的最大障礙�？顾幮允怯苫驔Q定的,是可遺傳的復雜的生物進化現(xiàn)象,涉及到多個基因、多種機制的作用。鑒定新的抗藥性基因并研究其如何參與抗藥性成為蚊媒抗藥性領(lǐng)域新的研究熱點。本實驗室前期采用抑制性差減雜交(SSh)結(jié)合cDNA芯片法高通量篩選,獲得多個蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)基因,其中包括在抗性品系中高表達的核糖體蛋白s29基因(rps29),且已證明RPS29與蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)。 本課題在前期工作基礎(chǔ)上,通過串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification,TAP)方法找尋RPS29相互作用蛋白,并用GST-pull down及免疫熒光兩種方法加以驗證；通過將RPS29與其相互作用蛋白共同高、低表達的方法研究二者相互作用對蚊細胞溴氰菊酯抗性的影響；通過實時熒光定量PCR結(jié)合Western blot的方法,探究RPS29與相互作用蛋白之間的作用機制。 本研究通過TAP方法成功獲得RPS29相互作用蛋白質(zhì)CYP6N3。GST-pull downs實驗結(jié)果表明,RPS29與CYP6N3可在體外發(fā)生直接相互作用。免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPS29在細胞質(zhì)與細胞核均有分布,CYP6N3在細胞質(zhì)分布,RPS29與CYP6N3可在細胞質(zhì)發(fā)生相互作用。 將RPS29與CYP6N3共同高表達,在溴氰菊酯各濃度組處理后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPS29高表達組的細胞存活率呈下降趨勢,CYP6N3高表達組的細胞存活率呈上升趨勢,而RPS29與CYP6N3共同高表達組的細胞存活率介于二者之間。將RPS29低表達,在溴氰菊酯各濃度組處理后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPS29低表達組的細胞存活率有所上調(diào),CYP6N3高表達組的細胞存活率呈上升趨勢,而RPS29低表達CYP6N3高表達組的細胞存活率高于所有組別。將CYP6N3低表達,在溴氰菊酯各濃度組處理后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CYP6N3低表達組的細胞存活率呈下降趨勢,RPS29高表達組的細胞存活率亦呈下降趨勢,RPS29高表達CYP6N3低表達組的細胞存活率低于所有組別。 為進一步研究RPS29與CYP6N3相互作用機制,本研究將CYP6N3梯度高表達,實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)RPS29mRNA表達水平未發(fā)生改變；western blot檢測發(fā)現(xiàn)RPS29蛋白表達呈梯度增高的趨勢。將RPS29梯度高表達,實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)CYP6N3mRNA表達水平未發(fā)生改變；western blot檢測發(fā)現(xiàn)CYP6N3蛋白表達呈梯度下降的趨勢。蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后,被抑制的CYP6N3蛋白表達呈明顯的時間梯度恢復。 本研究首次篩選RPS29相互作用蛋白質(zhì)；證明RPS29與CYP6N3可在細胞內(nèi)外發(fā)生相互作用,且二者相互作用可以調(diào)控蚊細胞溴氰菊酯抗性；而且探討了RPS29與CYP6N3相互作用機制。本研究結(jié)果為進一步闡明殺蟲劑抗性機制和建立新的抗藥性檢測方法提供科學依據(jù)。 第二部分核糖體蛋白S29(RPS29)參與核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究 RPS29是核糖體小亞基上的成員,在進化上高度保守。有研究報道,RPS29具有鋅指結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)可以使蛋白質(zhì)與DNA或者RNA結(jié)合。本研究前期結(jié)果發(fā)現(xiàn),RPS29可在細胞核分布。以上結(jié)果表明RPS29可能作為轉(zhuǎn)錄因子。因此,本課題進一步研究了RPS29對其它核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制。 核糖體是細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成場所。大量研究表明其亦與細胞生長、分化、胚胎發(fā)育、腫瘤、免疫疾病等緊密相關(guān)。核糖體的構(gòu)建是一項高度精密的過程,需要大量特定的基因協(xié)同表達與調(diào)控。當某一核糖體蛋白過度表達、缺失或結(jié)構(gòu)異常,均會影響核糖體的組裝,進而導致蛋白質(zhì)合成異常,影響細胞功能。上游啟動子對核糖體蛋白基因協(xié)同表達的影響主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上。目前,上游啟動子對核糖體蛋白基因協(xié)同表達影響的研究,主要集中于尋找上游啟動子區(qū)域的共調(diào)控元件。Wong小組發(fā)現(xiàn)人核糖體蛋白基因啟動子區(qū)域有5個保守結(jié)構(gòu)域,將其命名為MSMs,并推測這5個MSMs可能作為核糖體蛋白基因協(xié)同表達共調(diào)控元件。 本研究在本實驗室與Wong小組前期工作的基礎(chǔ)上,在4株不同細胞系中,通過RNA干涉的方法低表達RPS29,研究其對其它核糖體蛋白mRNA表達的影響；采用雙熒光報告系統(tǒng)檢測MSMs功能,并低表達RPS29后,再檢測其功能改變情況；通過凝膠遷移(electrophoretic mobility shift assay, EMS A)方法研究RPS29與MSMs相互作用情況。 將RPS29低表達后,通過芯片檢測70種核糖體蛋白mRNA情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在4株細胞系中,絕大部分核糖體mRNA表達均發(fā)生下調(diào)。根據(jù)核糖體蛋白在大小亞基上的分布,將大亞基上下調(diào)的核糖體蛋白數(shù)目與小亞基上下調(diào)的的核糖體蛋白數(shù)目比較,結(jié)果顯示,在4株細胞系中,大、小亞基上下調(diào)的核糖體蛋白數(shù)目相近,比率均接近于1。當RPS29下調(diào)后,有20種核糖體蛋白在4株細胞系中均下調(diào)。本研究隨機選取其中10種核糖體蛋白,檢測RPS27下調(diào)后,這10種核糖體蛋白mRNA表達情況。結(jié)果顯示,在4株細胞系中,10種核糖體mRNA表達大部分未改變,少部分上調(diào)。 采用雙熒光報告系統(tǒng),在16hBE、LTEP-a-2、 A549等3株細胞系中,檢測5個MSMs功能。結(jié)果表明,MSM-a, MSM-b、MSM-c、MSM-d在3株細胞系中均有顯著的增強效應,而MSM-e未檢測出。將RPS29低表達后,在16hBE細胞系中,MSM-d的增強效應顯著下調(diào)；在LTEP-a-2細胞系中,MSM-b與MSM-d的增強效應顯著下調(diào)；在A549細胞系中,MSM-a與MSM-d的增強效應顯著下調(diào)。進一步通過EMSA實驗檢測RPS29與MSMs相互作用情況,結(jié)果顯示RPS29與MSMs未能發(fā)生直接相互作用。 本研究發(fā)現(xiàn)RPS29可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其它核糖體蛋白協(xié)同表達；并首次通過實驗證明MSMs具有增強子功能,且RPS29可以影響MSMs這一功能；率先提出RPS29與MSMs間接相互作用調(diào)控其它核糖體蛋白協(xié)同表達這一觀點。本研究結(jié)果為闡明核糖體蛋白基因協(xié)同表達調(diào)控機制提供科學依據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R51;R3411

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本文編號：1630328