本文選題：無(wú)償獻(xiàn)血人群　切入點(diǎn)：隱匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是危害人類(lèi)健康的最嚴(yán)重問(wèn)題之一。HBV具有全球流行性,我國(guó)的流行率雖從1992年的9.75%下降到2006年的7.18%,但我國(guó)慢性HBV感染者仍有9300萬(wàn)人,慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)人,每年因HBV導(dǎo)致的肝硬化和肝癌死亡的人數(shù)約有30多萬(wàn)人,新發(fā)乙型肝炎有50-100萬(wàn)例。有研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)輸血傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于丙型肝炎病毒與艾滋病病毒,其風(fēng)險(xiǎn)主要來(lái)自血清轉(zhuǎn)換前的窗口期、變異病毒株與隱匿性乙型肝炎病毒3個(gè)方面。近來(lái)發(fā)現(xiàn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陰性的患者體內(nèi)也存在著HBV DNA,部分HBsAg-/HBV DNA+的獻(xiàn)血者可引起輸血傳播,嚴(yán)重影響了輸血安全,這種HBsAg-/HBV DNA+的感染稱(chēng)為隱匿性乙型肝炎感染(OBI)。2008年歐洲肝病研究協(xié)會(huì)(EASL)隱匿性HBV感染國(guó)際工作組對(duì)OBI進(jìn)行了定義：將采用現(xiàn)行可利用的方法在肝臟中檢出HBV DNA、血清(漿)中檢出或檢不出HBV DNA、HBsAg陰性的個(gè)體定義為OBI。在實(shí)際操作中,肝臟較難獲得且檢測(cè)難度較大,影響因素較多,因此,OBI定義為：機(jī)體存在乙肝病毒DNA,但無(wú)法檢測(cè)到乙肝病毒表面抗原的HBV感染,可伴有或不伴有乙肝病毒核心抗體(抗-HBc)或者乙肝病毒表面抗體(抗-HBs)。 HBV可分為A-H8個(gè)基因型,其分布具有明顯的地域性,也與人種有關(guān)。歐洲北部、西部以及美國(guó)主要為A型,B、C型主要分布于亞洲,而D型分布最廣,我國(guó)北方地區(qū)以C基因型為優(yōu)勢(shì)株,南方地區(qū)B型最常見(jiàn)。OBI的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制現(xiàn)在仍然不清楚,可能機(jī)制包括：(一) HBsAg和抗-HBs結(jié)合形成了免疫復(fù)合物；(二)變異體的形成影響了HBsAg編碼區(qū)S基因?qū)Α癮”抗原決定簇的編碼；(三)與其它肝炎病毒合并感染可能影響了HBV的復(fù)制,減少了HBsAg的合成。HBsAg的檢測(cè)作為我國(guó)HBV檢測(cè)的唯一指標(biāo),核酸檢鋇(?)(nucleic acid test,NAT)還沒(méi)有納入法定項(xiàng)目,輸血存在HBV窗口期感染和OBI感染的輸血?dú)堄囡L(fēng)險(xiǎn),國(guó)內(nèi)對(duì)B、C型OBI的研究停留在起步階段,沒(méi)有詳細(xì)的OBI流行病學(xué)調(diào)查,關(guān)于B、C型OBI的分子生物學(xué)特性的分析也只有零星的報(bào)道,沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步詳盡的研究,本課題對(duì)我國(guó)B、C型OBl分子生物學(xué)的研究具有重要意義：1,調(diào)查我國(guó)深圳地區(qū)OBI的流行情況；2,探討我國(guó)B、C型OBI的分子生物學(xué)特征；3,為OBI基因型B和C的監(jiān)測(cè)與防控策略提供重要依據(jù),改進(jìn)血液安全篩查方法；4,為OBI的臨床發(fā)生、發(fā)展和個(gè)性化治療方案提供理論指導(dǎo)。 材料：2010年4月-2012年12月深圳市血液中心采集的310,167份無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本,其中初次獻(xiàn)血者114,761份,占37%,重復(fù)獻(xiàn)血者195,406份,占63%,所有標(biāo)本經(jīng)過(guò)表面抗原(膠體金試紙)與ALT(羅氏干式生化分析儀)初篩,然后進(jìn)行酶免法(EIA)法和多聯(lián)病毒核酸篩查技術(shù)檢測(cè)。 方法：(1)無(wú)償獻(xiàn)血者樣本經(jīng)進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)兩種試劑進(jìn)行HBsAg的檢測(cè),經(jīng)美國(guó)諾華公司的TIGRIS全自動(dòng)血液核酸檢測(cè)儀進(jìn)行三聯(lián)熒光病毒單人份檢測(cè),使用化學(xué)發(fā)光法(CMIA,雅培)進(jìn)行HBsAg的確認(rèn)。(2)用QPCR方法進(jìn)行HBsAg-/DNA+樣本HBV病毒載量的測(cè)定。(3)對(duì)HBsAg-/DNA+樣本進(jìn)行基本核心啟動(dòng)子／前C區(qū)(BCP/PC)、HBV全基因、Pre-S/S區(qū)、S區(qū)、Pre-C/C區(qū)的巢式PCR的擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序。(4)從GeneBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)挑選我國(guó)B型和C型HBV野毒株作為OBI變異株的參考序列；使用MEGA軟件分析OBI的S區(qū)序列以確定基因型。(5)將OBI樣本全基因序列分為Pre-S/S、Pol、 X、Pre-C/C,每個(gè)區(qū)核苷酸翻譯成蛋白序列后和相應(yīng)基因型的野毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析。(6)與野毒株基因序列比對(duì),分析OBI毒株全基因序列調(diào)控元件變異特點(diǎn)以及引起的HBV生物學(xué)特征改變,包括啟動(dòng)子區(qū)域(SP1、SP2、CP、XP)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列區(qū)(CURS、DR1、DR2、和NRE)、增強(qiáng)子區(qū)(ENH1和ENH2)。(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS(13.0)統(tǒng)計(jì)分析軟件,以Pearson Chi-Square檢驗(yàn)分析變量數(shù)據(jù),比較OBI序列中氨基酸與調(diào)控序列的變異率與野毒株序列的差異；以Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析連續(xù)變量數(shù)據(jù),比較兩組樣品HBV DNA病毒載量的差異；所用的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1.OBI樣品的分類(lèi)與鑒定：(1)從310,167份無(wú)償獻(xiàn)血者標(biāo)本中共篩查出121份HBsAg-/DNA+樣本,其中6例樣品(SZ81、SZ82、D1、D3、D7、D17)確定為假陽(yáng)性樣本,有4例樣品(SZ7、SZ10、SZ31、SZ33)經(jīng)追蹤后發(fā)現(xiàn)HBsAg轉(zhuǎn)為陽(yáng)性,有12例樣品(SZ16、SZ21、SZ22、SZ54、SZ55、SZ80、D5、 D6、D10、D15、D21)5項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物為陰性,同時(shí)缺乏追蹤數(shù)據(jù),為窗口期樣本或原發(fā)OBI,其余99例HBsAg-/DNA+樣品確定為OBI。深圳市的OBI感染率為1：3133(99/310167)；(2)99份OBI樣本中擴(kuò)增出91例BCP/PC、20例全基因、31例Pre-S/S、18例S、55例Pre-C/C。99例OBI樣品S區(qū)經(jīng)軟件MEGA進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,其中B型有57例,C型12例,還有30例OBI樣品未能定型。在99例OBI樣品中,男性72人,女性27人,ALT水平正常(40),HBsAb陽(yáng)性HBcAb陽(yáng)性的有31例(31%),病毒載量范圍介于不能定量(1IU/m1)到798.7IU/ml(中位數(shù)為61.8IU/ml)。HBsAb陽(yáng)性HBcAb陰性的有12例(12%),病毒載量介于不能定量(1IU/m1)到1205IU/ml(中位數(shù)為63.87IU/ml)。HBsAb陰性HBcAb陽(yáng)性有53例(54%),病毒載量介于不能定量(1IU/m1)到1062IU/ml(中位數(shù)為53.86IU/ml)。HBsAb陰性HBcAb陰性的有3例(經(jīng)追蹤,3%),病毒載量介于13.35-5506IU/ml,中位數(shù)101.2IU/ml。OBI樣品年齡為20-56歲,中位數(shù)為35歲,病毒載量介于不能定量(1IU/m1)到2122IU/ml(中位數(shù)為27.9IU/m1),窗口期樣品年齡為19-41歲,病毒載量介于不能定量(1IU/m1)到2782IU/ml(中位數(shù)為63.5IU/ml)。 2.OBI毒株調(diào)控區(qū)序列變異分析：(1)B型和C型OBI毒株的DR1、DR2和NRE區(qū)域高度保守；(2)B型和C型的SP1、SP2、ENH1和ENH2的核苷酸變異率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.05)；(3)B型OBI毒株CURS區(qū)域核苷酸變異率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P=0.037)；(4)C型OBI毒株BCP區(qū)域核苷酸變異率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P=0.002)。B型OBI毒株中BCP區(qū)域有40%的樣品出現(xiàn)第1752位核苷酸的突變,38%的樣品出現(xiàn)CURS區(qū)域內(nèi)第1726核苷酸的突變。C型OBI樣品中有31%的樣品出現(xiàn)第1799位核苷酸的突變,46%樣品出現(xiàn)CURS區(qū)域內(nèi)第1727位氨基酸的突變,沒(méi)有出現(xiàn)缺失和插入,同時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)第1762位與第1764位核苷酸的突變。 3.OBI基因組蛋白序列變異分析：(1)Pre-S/S蛋白氨基酸序列,B型和C型OBI毒株氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.0001)。C基因型毒株中Pre-S1區(qū)域的氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.0001),B型OBI毒株P(guān)re-S2和S區(qū)域氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.05),MHR是突變發(fā)生的頻繁區(qū)域。B型和C型OBI毒株氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.05),B型OBI毒株中突變主要集中在aal30-aal34之間,頻率最高的是F134I/L和G130R/A,分別出現(xiàn)13次(18%)和9次(12%),樣品SZ5、SZ98和D11分別在MHR區(qū)域的aa121、aa118和124處插入氨基酸SPPTGTGS、 IPGSPPTG和PR,樣品SZ17在aa185處出現(xiàn)終止密碼；(2)P蛋白氨基酸序列,B型和C型OBI毒株氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.001)。P蛋白的重要功能區(qū)YMDD和FLLA區(qū)均高度保守,47%的B型OBI樣品中出現(xiàn)了K73N、V458D/A、A568T的突變。3個(gè)C型OBI毒株都發(fā)生了E73D的突變,SZ5該樣品在第471氨基酸處插入NSRTITTNP9個(gè)氨基酸,樣品SZ15在第477氨基酸處插入氨基酸TQ；(3)Pre-C/C蛋白氨基酸序列,C型OBI毒株氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P=0.034),29%的B型OBI毒株出現(xiàn)了G1896A的變異,C型OBI毒株中也出現(xiàn)4個(gè)該突變,從而使aa28出現(xiàn)終止密碼子,阻止HBeAg的翻譯。樣品SZ28、SZ39和D14分別出現(xiàn)了第1839位、第1876位和第1841-1845位核苷酸的缺失,導(dǎo)致了移碼突變,出現(xiàn)終止密碼；(4)X蛋白氨基酸序列,B型和C型OBI樣品氨基酸突變率與野毒株對(duì)比有顯著性差異(P0.0001)。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)從310,167份無(wú)償獻(xiàn)血者血樣中篩查出121份HBsAg-/DNA+樣品,其中99份確認(rèn)為OBI樣品,深圳地區(qū)OBI的流行以B基因型占多數(shù)。Pre-S/S蛋白氨基酸的插入、MHR區(qū)域氨基酸的突變、Pre-C/C蛋白氨基酸的終止以及眾多調(diào)控序列的突變都可能影響了HBV的復(fù)制與蛋白的表達(dá),與OBI的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。本研究結(jié)果為改進(jìn)血液安全篩查方法,以及為OBI臨床發(fā)生、發(fā)展和個(gè)性化治療方案提供了重要數(shù)據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 耿秀鳳;HBsAg陰性獻(xiàn)血者乙型肝炎病毒感染調(diào)查[J];中國(guó)輸血雜志;2005年05期

2 容瑩;鄭欣;葉賢林;曾勁峰;熊文;李活;王文敬;;無(wú)償獻(xiàn)血者隱匿性乙型肝炎病毒Pre-S/S區(qū)變異的研究[J];中國(guó)輸血雜志;2011年07期

3 李梵;王慧芬;徐東平;;乙型肝炎病毒基因突變與重型肝炎/肝衰竭發(fā)生的關(guān)系[J];實(shí)用肝臟病雜志;2008年03期

4 ;Gene heterogeneity of hepatitis B virus isolates from patients with severe hepatitis B[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2005年04期

5 葉賢林;鄭欣;杜鵬;;深圳獻(xiàn)血人群隱匿性乙型肝炎病毒全基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析[J];中國(guó)輸血雜志;2013年04期

6 歐山海;袁權(quán);倪宏英;陳清瑞;林永財(cái);周海容;林雪琴;陳長(zhǎng)榮;;無(wú)償獻(xiàn)血者隱匿性乙肝感染的分子生物學(xué)特征研究[J];中國(guó)輸血雜志;2010年S1期

，

本文編號(hào)：1581825