本文選題：腎綜合征出血熱　切入點：漢坦病毒　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由漢坦病毒引起的急性傳染性疾病,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,疫源地分布于5大洲70多個國家,已成為世界公共衛(wèi)生問題。我國是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國家,年報告發(fā)病人數(shù)約為4萬-6萬,占世界報告病例總數(shù)的90%以上。HFRS嚴(yán)重危害人民的生命健康安全,是我國重點防治的急性傳染病之一。近些年來合并較多并發(fā)癥的HFRS病例在臨床上越來越多地出現(xiàn),這些病例極易進(jìn)展至多器官功能衰竭、顱內(nèi)出血和彌散性血管內(nèi)凝血,這些亦是該病導(dǎo)致死亡的主要原因,因此雖然近幾年腎綜合征出血熱的年發(fā)病率有所下降,但針對該病的防控形勢卻越來越嚴(yán)峻。目前市場上還沒有腎綜合征出血熱的特效治療藥物,臨床上主要以對癥治療為主。研究表明抗?jié)h坦病毒中和抗體可以快速有效地中和體內(nèi)的漢坦病毒,達(dá)到治療的目的,所以通過抗?jié)h坦病毒中和抗體治療腎綜合征出血熱,已經(jīng)成為國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)和生物制藥專家的共識。本實驗嘗試?yán)没趩渭?xì)胞PCR技術(shù)的全人源單克隆抗體制備技術(shù),進(jìn)行抗?jié)h坦病毒全人源中和抗體的研制。首先采集了4名腎綜合征出血熱患者的恢復(fù)期外周血共80m L,通過密度梯度沉降法,從這些外周血中分離出淋巴細(xì)胞。然后根據(jù)B細(xì)胞表面分子標(biāo)記特征對分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記,通過流式細(xì)胞分選儀分選CD3-/CD20-/CD19+/C D27+/CD38+的單個漿細(xì)胞,共分選獲得2200個B淋巴細(xì)胞。接下來分兩步從單個B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因。由于單B細(xì)胞中的抗體基因序列是未知的,而抗體基因又具有豐富的亞型,因此第一步以覆蓋絕大部分抗體可變區(qū)基因家族的18條引物進(jìn)行RT-PCR,在一個反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增單個B細(xì)胞中抗體的輕鏈可變區(qū)基因和重鏈可變區(qū)基因;第二步再以RT-PCR的產(chǎn)物做為模板,分三個反應(yīng)體系進(jìn)行巢式PCR,分別擴(kuò)增H鏈、κ鏈以及λ鏈可變區(qū)基因,重鏈擴(kuò)增VDJ重鏈基因區(qū)段,輕鏈擴(kuò)增VJ輕鏈基因區(qū)段,混合引物包括針對每一個抗體可變區(qū)基因家族的特異引物。最終從2200個單個B淋巴細(xì)胞中獲得了427個H鏈可變區(qū)基因片段、880個κ鏈可變區(qū)基因片段458個λ鏈可變區(qū)基因片段,陽性比例分別為20%、40%和21%,輕鏈中κ鏈和λ鏈的占比分別為66%和34%,基本符合人的表達(dá)κ鏈和λ鏈的B細(xì)胞的比例,其中輕重鏈基因天然配對且唯一的抗體基因是130對。獲取抗體基因后需要進(jìn)行抗體表達(dá)和篩選,但是傳統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞表達(dá)抗體的方式費時費力,為了加速初期篩選,我們嘗試?yán)镁�性表達(dá)框表達(dá)130對抗體基因。構(gòu)建線性表達(dá)框時將CMV啟動子、抗體信號肽序列、抗體輕/重鏈的可變區(qū)基因序列、抗體輕/重鏈恒定區(qū)序列和poly A信號序列等轉(zhuǎn)錄翻譯必需元件通過一步重疊延伸PCR構(gòu)建成一個完整的線性片段,將輕/重鏈線性片段共轉(zhuǎn)染HEK-293懸浮細(xì)胞,130個抗體中120個獲得表達(dá),與傳統(tǒng)的克隆方法相比,通過線性表達(dá)框表達(dá)抗體,大大降低了工作量,在3-4天內(nèi)便可獲得可用于后續(xù)篩選的抗體。線性表達(dá)框表達(dá)抗體的水平多數(shù)可以達(dá)到1.2μg/m L以上,可以滿足抗體特異性篩選的需要。隨后以滅活的漢坦病毒作為抗原,通過ELISA對成功表達(dá)的抗體進(jìn)行了特異性檢測,結(jié)果顯示,120個單抗中有51個可以特異性結(jié)合滅活的漢坦病毒,占42.5%。隨后我們從這51個單抗中挑選30個特異性較高的單抗,將其輕重鏈構(gòu)建到表達(dá)載體中,并瞬時轉(zhuǎn)染到HEK-293懸浮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)純化,30個都獲得了表達(dá),純化后抗體濃度在0.5-1.2mg/m L之間�？贵w中和活性檢測我們采用的是熒光抗體病毒中和試驗,通過FITC標(biāo)記的抗?jié)h坦病毒單抗檢測病毒感染的細(xì)胞定量病毒,進(jìn)而判斷單抗的中和作用。通過檢測我們篩選到2個具有中和活性的抗體(20C8、11H11),兩者中和效果都存在劑量依賴關(guān)系,其中11H11中和作用明顯強(qiáng)于20C8,0.16μg的11H11可以中和70%200 TCID50病毒,而中和同樣的病毒需要0.64μg的20C8。以滅活的漢坦病毒作為抗原,采用ELISA方法初步測定抗體與抗原的結(jié)合力,20C8的結(jié)合EC50約為8.3×10-8 mol/L,11H11的結(jié)合EC50約為1.8×10-6 mol/L。漢坦病毒結(jié)構(gòu)蛋白G1和G2蛋白是兩個主要的中和抗原,預(yù)期以這兩個蛋白作為抗原篩選特異性抗體,分別用HEK-293懸浮細(xì)胞和畢赤酵母表達(dá)這兩個蛋白的膜外區(qū),結(jié)果在畢赤酵母中G2蛋白有少量表達(dá),而G1沒有檢測到表達(dá)產(chǎn)物;G1和G2在HEK-293懸浮細(xì)胞中都可以實現(xiàn)表達(dá),但是G1和G2主要存在于細(xì)胞膜上,沒有分泌到細(xì)胞外。漢坦病毒中和抗原G1/G2的表達(dá)一直是世界性難題,后續(xù)需要在現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上開展進(jìn)一步研究,為確定20C8和11H11的抗原表位,并深入評價這兩株抗體的親和力和特異性奠定基礎(chǔ)。利用本課題所建立的單B細(xì)胞全人源抗體制備技術(shù),可以從傳染病患者或者疫苗免疫者外周血出發(fā)制備預(yù)防或治療性抗體,是研制突發(fā)傳染病病原體中和抗體的有效手段;本研究篩選到的兩個具有中和活性的抗?jié)h坦病毒單抗,經(jīng)過進(jìn)一步的評價和優(yōu)化,可能成為潛在的治療HFRS的被動免疫制劑。
[Abstract]:Hemorrhagic fever with renal syndrome (hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) is an acute infectious disease caused by Hantavirus, widely popular in the world, the foci located in 5 continents in more than 70 countries, the world has become a public health problem. China is the most serious epidemic situation of HFRS in the world, the incidence of about the number of years 40 thousand -6 million, accounting for more than 90% of the total number of reported cases in the world.HFRS serious harm to people's health and safety, is one of the acute infectious disease prevention in China. In recent years, with more complications of HFRS cases appears more and more in clinical practice, these cases can easily progress of multiple organ failure, intracranial hemorrhage and disseminated intravascular coagulation, the disease is the leading cause of death, although it has declined in recent years the incidence of hemorrhagic fever with renal syndrome rate, but for the disease prevention and control situation But more and more serious. There is no specific treatment of hemorrhagic fever with renal syndrome syndrome on the market, the main clinical symptomatic treatment. The research showed that neutralizing anti hantavirus antibody effectively neutralize hantaviruses, achieve the purpose of treatment, so by neutralizing anti hantavirus antibody in the treatment of hemorrhagic fever with renal syndrome has become. The consensus of clinical medicine and bio pharmaceutical experts at home and abroad. The experiment of using technology fully human monoclonal antibody preparation of single cell based on PCR technology, research of anti hantavirus human neutralizing antibody. The first collection of 4 patients with hemorrhagic fever with renal syndrome recovery of peripheral blood 80m L by density gradient sedimentation, isolated lymphocytes from the peripheral blood. And then were labeled according to B cell surface markers characteristic of lymphocyte separation by flow cytometry. A single cytoplasm sorter sorting CD3-/CD20-/CD19+/C D27+/CD38+, were obtained from the 2200 B lymphocytes. The following two step amplification antibody gene from a single B cell. The antibody gene sequence of single B cells is unknown, but the antibody gene has subtype and rich, so the first step is to cover the vast gene RT-PCR most of the family of the antibody variable region 18 primers, and the amplified gene of light chain variable region gene single antibody in B cells and the heavy chain variable region in a reaction system; the second step to the product of the RT-PCR as a template, three reaction system were amplified by nested PCR, H chain gene kappa chain and the lambda chain variable region heavy chain amplification of VDJ heavy chain gene, light chain amplification VJ light chain gene, gene specific primers for mixed primers including each antibody variable region of the family. From the end of 2200 single B lymph The gene fragment of 427 H chain variable region gene fragment of 880 cells, a kappa chain variable region 458 lambda chain variable region gene fragment, the positive rates were 20%, 40% and 21%, light chain kappa chain and lambda chain accounted for 66% and 34%, consistent with B cell kappa chain the expression of the lambda chain and the ratio of the antibody light and heavy chain genes and only natural pairing of 130. To obtain antibody genes needed after antibody expression and screening, but the traditional construction of expression vector was transfected into mammalian cells expressing antibody method is time-consuming and laborious, in order to accelerate the early screening, we try to use the linear expression frame expression 130 the antibody gene. The linear expression frame when CMV promoter and signal peptide sequence of antibody, antibody light / heavy chain variable region gene sequence, antibody light / heavy chain constant region sequence and poly A sequence signal transcription and translation essential element by one step heavy Overlap extension PCR constructs a complete linear fragment, the light / heavy chain linear fragments were transfected into HEK-293 cell suspension, 120 130 antibody was expressed, compared with the traditional method of cloning, expression of antibody box by linear expression, greatly reduces the workload in 3-4 days can be obtained for subsequent antibody screening. Linear expression frame antibody level in most can reach more than 1.2 g/m L, can meet the needs of specific antibody screening. Then using inactivated Hantavirus as antigen by antibody ELISA on the successful expression of the specific detection, results showed that the 120 mAbs have 51 Specific combined with the inactivated hantavirus, accounting for 42.5%. from the 51 then we chose 30 monoclonal antibodies with high specificity monoclonal antibody, the light chain constructed into the expression vector, then transiently transfected into HEK-293 cells suspension Purification, 30 have been expressed, purified antibody concentration in 0.5-1.2mg/m L. Detection of antibody neutralizing activity we used the fluorescent antibody virus neutralization test, virus by cell quantitative anti hantavirus monoclonal antibody FITC labeled virus infection, and then judge neutralization monoclonal antibody. Through the detection we screened 2 neutralizing the activity of antibody (20C8,11H11), and both effects are dose-dependent, and the effect was stronger than the 20C8,0.16 11H 11 g 11H11 70%200 TCID50 can neutralize the virus, and the virus neutralization also requires 0.64 g 20C8. with inactivated hantavirus antigen, antibody and antigen binding assay using ELISA method, combined with EC50 20C8 is about 8.3 * 10-8 mol/L, with EC50 11H11 is about 1.8 * 10-6 mol/L. structural protein of Hantaan virus G1 and G2 proteins are two major neutralizing antibody The original, is expected to two of the protein as a screening of specific antibody antigen, respectively HEK-293 cell suspension and Pichia expression of extracellular domain of these two proteins results in Pichia pastoris G2 protein expression, while G1 did not detect the expression product; G1 and G2 can realize the expression in HEK-293 cell suspension however, G1 and G2 are mainly in the cell membrane, not secreted into the cell. The expression of Hantaan virus neutralizing antigen G1/G2 has been a worldwide problem, the need to carry out further research work on the existing basis, to determine the 20C8 and 11H11 antigen epitope, and in-depth evaluation of the two strains of antibody affinity and the specificity of the foundation. The preparation techniques of using the single cell B human antibody preparation, preparation of preventive or therapeutic antibodies from patients with infectious disease or vaccine of peripheral blood, is the development of infectious disease disease Two effective neutralizing antibodies against hantavirus are screened out. The further evaluation and optimization of these antibodies may be potential passive agents for the treatment of HFRS.

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.8

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本文編號：1577836