本文選題：弓形蟲　切入點：慢性感染　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)簡稱弓形蟲,弓形蟲是一種寄生于哺乳動物與人有核細(xì)胞內(nèi)的專性寄生的原蟲,呈世界性分布,引起人畜共患的弓形蟲病(Toxoplasmosis)。據(jù)估計,全世界成年人中至少有1／3的人感染,歐洲一些發(fā)達國家感染率高達80%。弓形蟲腦病的發(fā)病率也日趨增多,有報道90%以上全身弓形蟲病患者死于弓形蟲腦炎。弓形蟲是一種機會性致病原蟲,在免疫功能正常的宿主體內(nèi)通常形成包囊,造成慢性感染；在機體免疫功能缺陷或受到抑制時,處于隱性感染的蟲體可以活化,從緩殖子轉(zhuǎn)化為速殖子迅速增殖,破壞宿主細(xì)胞而引起多器官功能障礙,嚴(yán)重者甚至死亡。在弓形蟲感染急性期,速殖子通過血液或淋巴系統(tǒng)播散到各器官引起弓形蟲病,其特征是淋巴結(jié)腫大和網(wǎng)狀細(xì)胞增生。人類弓形蟲病大多數(shù)為隱性感染,呈無癥狀帶蟲狀態(tài),弓形蟲以包囊形式長期甚至終身潛伏于腦部組織、肌肉、視網(wǎng)膜及其他臟器。婦女在妊娠早期感染弓形蟲可引起流產(chǎn)、畸胎、死胎,或者引起胎兒先天性弓形蟲病,表現(xiàn)為智力低下、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎、癲癇等,這些癥狀在出生時或者成年后出現(xiàn)。同時,弓形蟲病又是一種人畜共患病,可以引起動物的流產(chǎn)、死胎等,給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。由于在人群中弓形蟲患病率較高,有必要更好地研究弓形蟲感染對宿主影響的機制。 近年來,弓形蟲感染對腦功能的影響逐漸受到研究者的關(guān)注。獲得性弓形蟲病患者常表現(xiàn)為彌漫性腦病,或伴有癲癇發(fā)作、腦膜腦炎、單個或多發(fā)進行性大病灶及占位性病變,并可見于精神運動障礙者。精神分裂癥是一種嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)精神性疾病(neuropsy chiatric disease),其病因尚不清楚。估計全世界成年人中大約1%的人患有精神分裂癥,它通常是一種進行性加重的伴隨終身的疾病。弓形蟲感染被認(rèn)為可能是精神分裂癥的候選病因之一。然而,一些研究報道精神分裂癥患者的異常行為、居住環(huán)境惡劣和特殊的生活方式等導(dǎo)致該人群弓形蟲感染率增加。有研究報道弓形蟲一旦進入宿主體內(nèi),速殖子一方面通過滲透機制進入胎盤屏障或者腸粘膜屏障,另一方面通過單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞進入血液循環(huán),然后穿過血腦屏障,在腦內(nèi)的重要部位播散,有可能引起嚴(yán)重的急性病理改變或形成慢性弓形蟲感染。另外,弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲,細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在控制弓形蟲感染中發(fā)揮了重要作用。弓形蟲感染者通過細(xì)胞免疫來抑制包囊的活化,從而使弓形蟲以包囊的形式長期存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等部位。弓形蟲具有親神經(jīng)細(xì)胞的特性可以通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng),侵襲大腦神經(jīng)細(xì)胞,對宿主的辨別力和記憶功能等造成損害。在慢性階段,弓形蟲能長期潛伏在腦內(nèi),伴發(fā)弓形蟲感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個顯著特征是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的顯著活動,特別是星形膠質(zhì)細(xì)胞。有研究認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞活動可能是導(dǎo)致精神分裂癥發(fā)生的原因之一。有些研究報道速殖子可能侵入不同的神經(jīng)細(xì)胞,包括大腦的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞以及小腦的浦肯野細(xì)胞,它們產(chǎn)生細(xì)胞因子可以影響宿主的炎性反應(yīng)。同時,活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可能與腦部弓形蟲的播散相關(guān)。 一些研究表明,弓形蟲感染可能嚴(yán)重影響宿主的神經(jīng)系統(tǒng)。在弓形蟲感染慢性期,小鼠是弓形蟲的主要中間宿主,表現(xiàn)出特定的行為變化,包括對貓氣味的厭惡轉(zhuǎn)變?yōu)閷ω垰馕兜奈?弓形蟲感染引起小鼠行為改變有利于弓形蟲傳播給終宿主貓,然而這些變化的具體機制尚不清楚。行為研究表明隱性弓形蟲感染可能會影響宿主的運動能力、破壞空間學(xué)習(xí)和記憶能力、焦慮感減輕、對新事物的探索能力下降、反應(yīng)時間延長、最重要的是對終宿主貓科動物的識別能力下降。弓形蟲偏嗜中樞神經(jīng)系統(tǒng),可能是由于其操縱宿主行為的特權(quán)。另外,人的認(rèn)知功能、個性改變與弓形蟲感染也具有相關(guān)性。雖然精神分裂癥是一種多因素疾病,但是藥物和遺傳研究表明,神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂與精神分裂癥相關(guān)。有研究報道精神分裂癥、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默病和帕金森氏病是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疾病；弓形蟲腦炎的癥狀可能類似于精神分裂癥和其他精神疾病的臨床表現(xiàn)。弓形蟲感染可能與神經(jīng)精神性疾病所引起的情志和行為改變相關(guān)。弓形蟲感染引起的神經(jīng)元變性可能是神經(jīng)退行性疾病重要的發(fā)病機制之一,尤其值得注意的是阿爾茲海默癥是老年癡呆中最常見的類型,是一種進行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病,臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化,日常生活能力進行性減退,并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。 許多研究認(rèn)為精神分裂癥是一種神經(jīng)發(fā)育疾病,孕期感染弓形蟲可垂直感染胎兒,弓形蟲潛伏多年,可以在出生后或者成年后活化致�。淮罅康难芯勘砻鞴蜗x感染小鼠可以影響去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的代謝；精神分裂癥通常也使神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生異常改變,精神分裂癥模型與弓形蟲小鼠模型的行為表現(xiàn)一致。弓形蟲感染可能使多巴胺的積累和釋放增加,可能有助于弓形蟲和精神分裂癥的相關(guān)研究。有研究表明大腦的邊緣系統(tǒng)含有多巴胺,在運動控制(基底節(jié)),獎勵刺激,樂趣和依賴(海馬),動機、認(rèn)知和對特定刺激的恐懼(杏仁核)等方面起到重要的調(diào)控作用。另外,有研究報道一些抗精神病藥物能抑制弓形蟲速殖子的活性,從而改善弓形蟲感染所引起的宿主的行為改變。有關(guān)弓形蟲感染患者和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之間的研究報道主要局限于弓形蟲特異性抗體的血清學(xué)檢測,而精神分裂癥引起神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂的具體機制仍所知甚少。 另外,很少有研究報道多胺對動物行為以及學(xué)習(xí)和記憶功能的影響。多胺包括精胺、精脒、腐胺。L-精氨酸為多胺及一氧化氮(NO)的共同前體,細(xì)胞內(nèi)的L-精氨酸,一方面可在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成一氧化氮(NO),另一方面也可在精氨酸酶(Aginase)及鳥氨酸脫羧酶(ODC)作用下生成腐胺,腐胺再依次生成精脒、精胺。弓形蟲缺乏精氨酸酶不能將精氨酸轉(zhuǎn)換為腐胺,因此弓形蟲必須利用宿主的多胺來滿足自身的生長和增殖。 本研究利用弓形蟲Prugniaud弱毒株感染小鼠構(gòu)建弓形蟲慢性感染模型。同時對緩殖子期抗原進行HE染色和免疫組化分析；對多胺代謝限速酶鳥氨酸脫羧酶和精胺/精脒乙酰轉(zhuǎn)移酶進行分析,同時以高效液相色譜-電化學(xué)法對小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺進行檢測分析。鑒于此,本實驗將建立一個穩(wěn)定的弓形蟲Prugniaud株慢性感染動物模型,為進一步研究弓形蟲感染對腦部包囊的分布特點、多胺代謝和神經(jīng)遞質(zhì)的變化等方面的影響提供實驗工具。 目的 1.構(gòu)建慢性Prugniaud株弓形蟲感染小鼠模型； 2.觀察實驗小鼠腦內(nèi)包囊的時空分布特點； 3.探討弓形蟲感染對實驗小鼠腦內(nèi)多胺代謝酶的影響； 4.檢測弓形蟲感染對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響,為進一步探討弓形蟲感染引起的行為改變提供幫助。 方法 1.弓形蟲Prugniaud株經(jīng)口感染小鼠,弓形蟲感染后分別在1月,2月和3月采集小鼠血清,并于鏡下計算包囊的個數(shù)。 2.弓形蟲感染后1月和3月,采用2.5%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠,利用心臟灌注法固定小鼠腦組織,經(jīng)HE染色和免疫組化檢測腦組織內(nèi)緩殖子,觀察小鼠腦組織內(nèi)包囊的分布情況； 3.提取弓形蟲感染小鼠和正常小鼠腦組織前額和海馬部位的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用PCR的方法對弓形蟲感染小鼠和正常小鼠腦組織多胺類代謝限速酶鳥氨酸脫羧酶(ODC)及精胺/精脒乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)進行分析； 4.以高效液相色譜-電化學(xué)法對弓形蟲感染小鼠和正常小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)進行檢測分析。 結(jié)果 1.弓形蟲Prugniaud株經(jīng)口感染小鼠,小鼠從第9-12天時開始出現(xiàn)急性弓形蟲病的典型癥狀,即嗜睡、皺毛或彎腰駝背的姿勢,食欲減退等癥狀,死亡率為20%,第20天以后癥狀開始減輕,成功建立弓形蟲慢性感染小鼠模型； 2.免疫組化檢測小鼠腦內(nèi)包囊的分布情況顯示1個月和3個月弓形蟲感染小鼠前額皮質(zhì)、海馬、丘腦、小腦和杏仁核中的弓形蟲包囊密度均有顯著性差異(P0.001),其中,丘腦的包囊密度高于其它4個腦區(qū)(P0.01),小腦的包囊密度最少(P0.01),但是前額皮質(zhì)、海馬和杏仁核所含的包囊密度無顯著性差異(P0.05)。1個月弓形蟲感染小鼠杏仁核包囊密度低于3個月弓形蟲感染小鼠(F=18.314,P0.001),但是,1個月弓形蟲感染小鼠小腦的包囊密度高于3個月小鼠(F=18.574,P0.001)。 3.用PCR的方法對弓形蟲感染小鼠和正常小鼠腦組織內(nèi)多胺類代謝限速酶ODC及SSAT的進行定量分析；結(jié)果顯示弓形蟲感染小鼠腦組織ODC和SSAT的含量均高于正常小鼠(P0.001) 4.高效液相色譜-電化學(xué)法檢測弓形蟲感染小鼠與正常小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì),統(tǒng)計結(jié)果顯示弓形蟲感染小鼠和正常小鼠的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)之間存在顯著差異,其中,弓形蟲感染小鼠腦內(nèi)去甲腎上腺素降低(P0.05)和5-羥色胺降低(P0.005),而多巴胺升高(P0.05)。 結(jié)論 1.利用弓形蟲Prugniaud弱毒株包囊經(jīng)口感染小鼠,成功構(gòu)建了弓形蟲慢性感染模型； 2.弓形蟲包囊在慢性感染小鼠不同腦組織內(nèi)的分布具有時空特異性,這可能是其臨床表現(xiàn)的病理學(xué)基礎(chǔ)。 3.PCR結(jié)果顯示弓形蟲感染小鼠腦組織ODC和SSAT的含量均高于正常小鼠。 4.高效液相色譜-電化學(xué)法檢測顯示弓形蟲感染小鼠去甲腎上腺素降低,5-羥色胺降低,而多巴胺升高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R531.8

【參考文獻】

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