本文選題：慢性乙型肝炎　切入點(diǎn)：ENPP2　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:慢性乙型肝炎是一個(gè)極其嚴(yán)重并影響全人類健康的公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球60億人口中大約有20億人有HBV病毒感染的病史,其中約有3-4億人有HBV DNA病毒慢性感染的病史,而我國正是HBV病毒感染的高流行區(qū)。慢性乙型肝炎不經(jīng)過有效治療或者治療效果不佳時(shí),會(huì)逐步發(fā)展為肝衰竭、肝硬化甚至是原發(fā)性肝癌,而據(jù)統(tǒng)計(jì)每年大約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC),占全球疾病死亡率的第7位。目前慢性乙型肝炎主要的治療主要是干擾素和核苷(酸)類似物藥物治療,雖然這些藥物能夠在一部分患者使HBV DNA的復(fù)制得到有效控制,但仍有更大一部分患者疾病逐漸進(jìn)展,藥物并不能很好的改善。究其原因除了個(gè)體的差異性外,主要還是乙肝發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜化和多變化,而我們對(duì)這種變化的不清楚使得很多研究仍致力于對(duì)乙肝發(fā)病機(jī)制更深入的研究。本研究也是意在研究慢乙肝的發(fā)病機(jī)制。方法:本研究以肝癌細(xì)胞HepG2和在其基礎(chǔ)上建立的能夠復(fù)制HBV DAN病毒的慢乙肝肝癌細(xì)胞HepG2.2.15為研究對(duì)象,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法(同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù),ITRAQ)篩選可能涉及到與乙肝病毒復(fù)制有關(guān)的差異表達(dá)的分泌蛋白。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和蛋白免疫印跡Western Blot技術(shù)對(duì)篩選出明顯有差異的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。為了研究可能涉及的乙肝發(fā)病機(jī)制,本研究組選取ENPP2蛋白進(jìn)一步研究。本研究組采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Elisa、蛋白免疫印跡Western Blot等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ENPP2。為了研究ENPP2影響HBV DNA復(fù)制機(jī)制,本研究組分別給予ENPP2重組蛋白、ENPP2 siRNA、ENPP2質(zhì)粒、ENPP2抗體、LPA受體抑制劑處理HepG2.2.15細(xì)胞,檢測(cè)ENPP2、和LPA受體的,RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾素通路的變化,羅氏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HBV DNA、HBsAg、HBeAg含量的變化。結(jié)果:結(jié)合iTRAQ技術(shù)、相關(guān)生物學(xué)分析網(wǎng)站以及統(tǒng)計(jì)學(xué),我們篩選出133個(gè)有意義的蛋白,對(duì)比Hep G2細(xì)胞無血清培養(yǎng)上清液,有55種蛋白表達(dá)上調(diào),其余的78種則表達(dá)下調(diào)。通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和蛋白免疫印跡Western Blot驗(yàn)證一些差異顯著并與肝臟疾病相關(guān)的蛋白,其結(jié)果與iTRAQ結(jié)果一致。Elisa和Western Blot進(jìn)一步明確了ENPP2在慢性乙型肝炎患者中血清中普遍升高。大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HBV DNA的復(fù)制可以誘導(dǎo)ENPP2的表達(dá),且被誘導(dǎo)表達(dá)后的ENPP2呈現(xiàn)了對(duì)HBV復(fù)制的抑制作用,同時(shí)干擾素通路發(fā)生了協(xié)同性變化,LPA受體發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。結(jié)論:ENPP2在慢性乙型肝炎患者中普遍高表達(dá);且ENPP2可通過與LPA1-3受體作用抑制Hep G2.2.15細(xì)胞的HBV復(fù)制。
[Abstract]:Objective: chronic hepatitis B (CHB) is an extremely serious public health problem affecting the health of all mankind. According to statistics, about 2 billion out of 6 billion people in the world have a history of HBV infection. About 300 million of them have a history of chronic HBV DNA infection, and China is a highly endemic area for HBV infection. Chronic hepatitis B can develop into liver failure without effective treatment or poor treatment. Liver cirrhosis and even primary liver cancer. According to statistics, about 1 million people die every year from liver failure caused by HBV infection. Liver cirrhosis and primary hepatocellular carcinoma (HCC) account for the 7th highest mortality rate in the world. At present, the main treatment for chronic hepatitis B is interferon and nucleoside analogues. Although these drugs can effectively control the replication of HBV DNA in some patients, there are still a larger number of patients with progressive disease, and the drugs do not improve very well. Mainly because the pathogenesis of hepatitis B is complicated and varied. However, our lack of clarity about this change has led many studies to study the pathogenesis of hepatitis B. this study is also intended to study the pathogenesis of chronic hepatitis B. methods: this study is based on HepG2 and its base on liver cancer cells. On the basis of this study, HepG2.2.15 cell line, which can replicate HBV DAN virus, was used as the research object. Proteomics (isotopic relative labeling and absolute quantitative techniques) was used to screen secretory proteins that might be involved in differentially expressed HBV replication. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western blot Western were used to screen secretory proteins that might be related to HBV replication. In order to study the possible pathogenesis of hepatitis B, Blot technique was used to verify the screening of proteins with obvious differences. In order to study the effect of ENPP2 on the replication of HBV DNA, we selected ENPP2 protein for further study. In this study, HepG2.2.15 cells were treated with ENPP2 recombinant protein ENPP2 siRNA-ENPP2 plasmids and ENPP2 antibody against LPA receptor inhibitor. ENPP2and LPA receptor were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) to detect the changes of interferon pathway, and the changes of HBeAg content in HBV DNA-HBs were detected by Roche assay. Results: combined with iTRAQ technique, HBeAg was detected in HepG2.2.15 cells. Related biological analysis sites and statistics, we screened 133 meaningful proteins, compared with Hep G2 cell serum-free culture supernatant, 55 proteins were up-regulated. The other 78 down-regulated proteins were identified by real-time fluorescent quantitative RT-PCR and Western blot Western Blot. The results were consistent with the results of iTRAQ. Elisa and Western Blot further confirmed that ENPP2 generally increased in serum of patients with chronic hepatitis B. A large number of cell experiments showed that the replication of HBV DNA could induce the expression of ENPP2. The induced expression of ENPP2 could inhibit the replication of HBV, and the synergistic change of interferon pathway might play a key role in the expression of ENPP2. Conclusion the expression of ENPP2 is generally high in patients with chronic hepatitis B. ENPP2 inhibited HBV replication in Hep G2.2.15 cells by interaction with LPA1-3 receptor.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：1561124