發(fā)布時間：2018-03-02 02:17

  本文關鍵詞： 多重PCR 巢式PCR 卵形瘧原蟲wallikeri亞種　出處：《中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志》2015年02期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的應用新建的多重PCR體系檢測4種人體瘧原蟲。方法應用DNAman軟件比較分析4種人體瘧原蟲的18S r DNA基因序列,采用Oligo 6.0軟件,在其第5和第6保守區(qū)間的變異區(qū)設計4條下游引物序列,并以含4種瘧原蟲18S r DNA部分序列的質粒DNA為模板,檢測多重PCR體系的特異性和敏感性。此外,將新建的多重PCR體系與NP-1993體系的第1輪屬特異引物組合,形成新的巢式PCR擴增體系(M-Nest體系),并用該體系和新建的多重PCR體系對不同稀釋倍數的惡性瘧和間日瘧患者血樣DNA進行擴增,檢測這兩種體系的敏感性。應用M-Nest體系和NP-1993體系檢測廣西2013年自加納瘧疾高流行區(qū)返鄉(xiāng)人員的307份血樣,比較兩者的檢測結果是否一致。最后,應用M-Nest和NP-2002體系對廣西2014年1~5月份報告的66份鏡檢以卵形瘧原蟲感染為主的血樣進行復核,比較兩者的檢測結果是否一致。結果應用新建的多重PCR體系得到的惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和間日瘧原蟲的擴增片段大小分別為268、446、394和323 bp,且不同原蟲的擴增條帶恰好位于50 bp DNA標志物條帶之間,更易于區(qū)分,但不同瘧原蟲的Tm值較為接近,不易區(qū)分和鑒別蟲種。新建體系對4種瘧原蟲18S r DNA基因的最低檢出濃度分別為:惡性瘧原蟲5.58×102拷貝/μl,三日瘧原蟲1.56×103拷貝/μl,卵形瘧原蟲1.66×103拷貝/μl,間日瘧原蟲1.80×102拷貝/μl。新建體系對惡性瘧原蟲血樣的最低檢測濃度為1.43×102~8.84×103拷貝/μl或5.10×10~4.92×102個原蟲/μl,高于間日瘧原蟲的17.4~69.1拷貝/μl和13.5~83.2個原蟲/μl。與單獨的多重PCR體系相比,應用M-Nest檢測體系將對瘧原蟲的最低檢測濃度降低了10~100倍。M-Nest體系和NP-1993體系對從加納返鄉(xiāng)的307份血樣的檢測結果不一致,并且M-Nest體系還檢測到2例卵形瘧原蟲感染,而NP-1993體系則未能檢測到該感染。此外,M-Nest體系和NP-2002體系對66份鏡檢以卵形瘧原蟲感染為主的血樣的復核結果一致。結論新建的多重PCR檢測體系可同時檢測4種人體瘧原蟲,具有良好的現場適用性。
[Abstract]:Objective to detect the application of multiplex PCR for the new 4 species of human Plasmodium. Comparative analysis of 18S R DNA gene sequences of 4 species of human Plasmodium method using DNAman software, using Oligo 6 software, the design of 4 downstream primer sequences in the fifth and sixth conserved mutation interval, and the plasmid DNA containing 4 18S R DNA of Plasmodium sequence as a template, a multiplex PCR system for detection of specificity and sensitivity. In addition, the multiplex PCR system and NP-1993 system in the new round of first specific primer combinations, the formation of new nested PCR amplification system (M-Nest system), and the different dilution of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax DNA system and the blood samples of patients the new multiplex PCR amplification, detection sensitivity of these two systems. 307 blood samples by M-Nest system and NP-1993 system for the detection of the 2013 Guangxi home Garner malaria epidemic area personnel, comparison of the two The detection results are consistent. Finally, the application of M-Nest and NP-2002 system of Guangxi 1~5 in 2014 reported 66 microscopic examination of blood samples to Plasmodium falciparum infections mainly review, compare the results is consistent with the test results. The multiple application of PCR system of the new three Plasmodium falciparum malaria parasite, Plasmodium falciparum and amplified fragment size Plasmodium vivax were 268446394 and 323 BP, and different protozoa amplified bands located just 50 BP DNA markers between bands, more easy to distinguish, but different Plasmodium Tm value is close, not easy to distinguish and identify species. The new system of 4 species of Plasmodium 18S R DNA gene of the minimum detectable concentration respectively: 5.58 * 102 copies of Plasmodium falciparum / L, three, 1.56 * 103 copies / Plasmodium L, p.ovale 1.66 * 103 copies / L, 1.80 * 102 copies of Plasmodium vivax / L. new system for malignant The parasite samples the lowest detection concentration of 1.43 * 102~8.84 * 103 copies / L or 5.10 * 10~4.92 * 102 / L is higher than that of protozoa, Plasmodium vivax copies of 17.4~69.1 / L and 13.5~83.2 / L. protozoa and multiplex PCR system alone compared to the application of M-Nest detection system will be the lowest detection concentration of Plasmodium reduce the 10~100 times of.M-Nest system and NP-1993 system of Garner from returning 307 blood samples. The detection results are not consistent, and the M-Nest system is detected 2 cases of Plasmodium falciparum infection, while the NP-1993 system failed to detect the infection. In addition, M-Nest system and NP-2002 system to review the blood samples of 66 microscopic examination to Plasmodium falciparum infection the results are consistent. Conclusion the new multiplex PCR detection system for simultaneous detection of 4 species of human Plasmodium, has good applicability.

【作者單位】： 中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所衛(wèi)生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室世界衛(wèi)生組織瘧疾血吸蟲病和絲蟲病合作中心;
【基金】：國家質檢總局公益性行業(yè)科研專項(No.201210056)~~
【分類號】：R531.3

【參考文獻】

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