本文關(guān)鍵詞： HIV-1 耐藥突變 基因型耐藥 表型耐藥 復(fù)制能力　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：我國艾滋病免費抗病毒治療開始于2003年，其覆蓋率到2011年9月底達到73.5%。隨著抗病毒治療時間的延長，HIV-1感染者中抗病毒治療失敗的情況不斷出現(xiàn)，耐藥性毒株成為治療失敗的主要原因。我國艾滋病的抗病毒治療具有鮮明的特點，一是我國流行的HIV-1毒株以CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC及B亞型為主，與歐美等國以B亞型為主的情況顯著不同；二是使用的抗病毒藥物為國產(chǎn)仿制藥；三是采取鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療和疾控機構(gòu)統(tǒng)一發(fā)藥及管理病人的治療模式。這些特點使得我國HIV-1毒株的耐藥性具有自己的特點和規(guī)律。我國已經(jīng)開展了HIV-1耐藥毒株的流行病學(xué)監(jiān)測，獲得了耐藥毒株的流行率、影響因素、對抗病毒治療的影響等一系列重要的數(shù)據(jù)。在抗病毒治療發(fā)展的過程中，不斷有突變被新鑒定為耐藥突變，新突變對HIV-1耐藥的影響、突變模式、突變之間的相互作用以及新突變對HIV-1毒株的復(fù)制能力的影響還沒有深入的研究。本課題首先對部分地區(qū)HIV-1感染者的基線耐藥和HIV-1抗病毒治療失敗后的耐藥情況進行了分子流行病學(xué)研究。隨后對與抗病毒治療相關(guān)的突變及突變組合構(gòu)建了質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后利用重組病毒對我國常用抗病毒治療藥物進行了耐藥表型檢測，并使用合適的方法分析了單一位點的作用和不同位點之間可能存在的相互作用。最后對攜帶相關(guān)突變組合的病毒株的復(fù)制能力進行了研究。綜合全部研究結(jié)果，旨在掌握我國HIV-1耐藥毒株流行情況、闡明突變之間的相互作用及攜帶耐藥突變病毒的生物學(xué)特征，為臨床深入認(rèn)識HIV-1耐藥機理及耐藥病人的科學(xué)管理提供理論依據(jù)、為確保我國抗病毒治療效果提供實際指導(dǎo)。 第一部分我國部分地區(qū)HIV-1基因型耐藥的橫斷面研究 目前，耐藥HIV-1毒株在我國各地廣泛出現(xiàn)和流行，掌握耐藥毒株流行狀況是臨床有效治療病人的基礎(chǔ)。本部分研究旨在了解我國HIV-1耐藥毒株的分子流行病學(xué)特征，為進一步研究和臨床抗病毒治療提供指導(dǎo)。我們收集2009年全國范圍內(nèi)8個省市的304例從未接受抗病毒治療的艾滋病患者的血漿標(biāo)本和2010年河南和河北兩省476例一線抗病毒治療失敗的艾滋病患者的血漿標(biāo)本，采用HIV-1基因型耐藥檢測方法進行了基因型耐藥檢測，擴增目的基因片段長2.0kb，包含HIV-1蛋白酶的全部99個氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶的全部560個氨基酸，計算耐藥毒株流行率并分析耐藥相關(guān)的因素。 結(jié)果：（1）2010年河南省和河北省抗病毒治療失敗標(biāo)本擴增檢測成功321份，耐藥率高達67.6%，NRTIs和NNRTIs耐藥分別達到了54.21%（174/321）和65.42%（210/321）。NRTIs耐藥突變主要是TMAs突變和M184V；NNRTIs耐藥突變中以K103N和Y181C最為常見，其次是G190A/S和H221Y。Y181C和H221Y聯(lián)合突變在河北省和河南省的耐藥標(biāo)本中分別占到23.33%（7/30）和16.58%（31/187），K103N/Y181C/H221Y在河北省和河南省耐藥標(biāo)本中分別占6.67%（2/30）和11.76%（22/187）。（2）未接受抗病毒治療的標(biāo)本擴增檢測成功269份，基線耐藥率為7.43%；深圳的基線耐藥為17.86%，顯著高于其他地區(qū)（χ2=4.9327, P=0.0264）；B亞型的基線耐藥顯著高于非B亞型（P=0.0177）；NNRTIs耐藥突變包括K103N、Y181C、V179D/E、G190E和K238N；PIs耐藥突變中包括能夠引起NFV高度耐藥的N88S、D30N和L90M。在這些標(biāo)本中，新報道的HIV-1流行重組毒株CRF55_01B在2009年廣州和深圳的男男性行為人群中的流行率為9.84%。 結(jié)論：受到樣本量和標(biāo)本保存的影響，部分地區(qū)的擴增成功率較低，可能對結(jié)果有影響。本研究提供了部分地區(qū)抗病毒治療失敗耐藥和基線耐藥的概貌。河南和河北抗病毒治療失敗標(biāo)本中耐藥毒株的流行率非常高，嚴(yán)重地影響后續(xù)抗病毒治療效果。HIV-1基線耐藥的流行受到地區(qū)和病毒亞型的影響。近年來增長的男男性行為人群中HIV-1的流行亞型更為復(fù)雜。跟蹤基線耐藥病人的抗病毒治療效果有助于闡明基線耐藥對抗病毒治療的影響。 第二部分HIV-1特定基因突變的耐藥性鑒定 HIV-1的耐藥突變十分復(fù)雜，截止到2008報道的突變已經(jīng)達到200多個，且不斷有新的耐藥相關(guān)突變位點被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在藥物選擇壓力下，一些病毒基因的天然多態(tài)性位點很容易轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幭嚓P(guān)突變位點。目前，主要耐藥突變位點的作用已經(jīng)清楚，但對很多新出現(xiàn)的和由多態(tài)性位點轉(zhuǎn)變?yōu)槎鴣淼耐蛔兊哪退幾饔眉捌渑c主要突變之間的相互作用尚不明確。我國流行的HIV-1毒株亞型顯著不同于歐美國家，且我國采用獨特的國產(chǎn)仿制藥群體性治療的模式，，耐藥突變的發(fā)生和流行具有鮮明的特點。本研究的目的是闡明在我國接受抗病毒治療的艾滋病患者中廣泛流行的H221Y對耐藥的作用及其與其他突變的相互作用。我們從3名臨床耐藥的艾滋病患者血漿標(biāo)本中擴增獲得含有不同耐藥突變組合（K103N/Y181C/H221Y/T215Y、V179E/Y181C/H221Y/T215Y、K101Q/Y181C/H221Y）的3段HIV-1pol區(qū)基因，以HIV-1pNL4-3為骨架構(gòu)建重組病毒。以此為基礎(chǔ)，對特定位點進行定點突變或回復(fù)突變、轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（Humanembryonic kidney，HEK293T），收獲病毒，構(gòu)建含有不同突變組合的21株病毒，在MT2細(xì)胞上對病毒進行培養(yǎng)擴增，測定感染性滴度（50%tissue cultureinfectious dose，TCID50），在TZM-bl細(xì)胞上測定這些病毒對4種抗HIV藥物的敏感性，以pNL4-3病毒上定點突變的3株病毒作為參比。每種藥物設(shè)11個濃度梯度、2復(fù)孔、重復(fù)3次，計算50%抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50），采用析因設(shè)計的分析方法計算各個突變對耐藥的貢獻及突變之間的相互作用。 結(jié)果：（1）K103N/T215Y顯著提高EFV對病毒的IC50（88.98-fold），V179E/T215Y、Y181C和K101Q分別使EFV對病毒的IC50提高18.46-fold、6.12-fold和6.76-fold，H221Y單一突變幾乎不影響EFV的IC50值（1.41-fold）。分別使EFV的IC50提高88.98-fold和18.46-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y聯(lián)合突變均與H221Y無交互作用，而分別使EFV的IC50提高6.12-fold和6.76-fold的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用（F=12.49，P=0.0028；F=28.10，P0.0001）。H221Y可拮抗K101Q對EFV的耐藥作用，使其相對于野生型的IC50由提高6.76-fold降低到二者相當(dāng)。（2）K103N/T215Y和V179E/T215Y均顯著提高AZT對病毒的IC50（30.66-fold，13.72-fold）。Y181C顯著的降低了AZT對病毒的IC50（0.335-fold）。H221Y對IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。分別使AZT的IC50提高30.66-fold和13.72-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y聯(lián)合突變均與H221Y無交互作用，而分別使AZT的IC50改變0.335-fold和1.50-fold的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用（F=18.71，P=0.0051；F=10.53，P=0.0011）。H221Y可拮抗Y181C對AZT的耐藥作用，使其相對于野生型的IC50由降低0.335-fold提高到二者相當(dāng)。（3）K101Q單一位點使3TC對病毒的IC50降低0.48-fold，K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C對3TC的IC50幾乎沒有影響（1.35-fold、0.80-fold、1.29-fold）。H221Y對IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。H221Y可拮抗K101Q對3TC的耐藥作用，H221Y與V179E/T215Y有顯著的拮抗作用。K101Q、K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C均不會使d4T的IC50顯著改變，H221Y單一位點顯著提高d4T對病毒的IC50（4.71-fold）。181和221之間不存在交互作用（P=0.9708）。 結(jié)論：（1）我們首次采用析因分析設(shè)計實驗方法及分析檢驗方法發(fā)現(xiàn)了221單一位點突變對耐藥的貢獻及與其他位點的交互作用。（2）H221Y單一位點對d4T的耐藥顯著提高，對EFV的耐藥提高較小，對AZT和3TC的作用隨著一起出現(xiàn)的突變位點而不同。（3）Y181C單一位點顯著提高AZT的敏感性。（4）基礎(chǔ)突變分別對EFV和AZT耐藥的影響顯著時，H221Y單一位點對耐藥的作用及與基礎(chǔ)位點之間的交互作用不顯著。 第三部分?jǐn)y帶耐藥相關(guān)突變的HIV-1毒株的復(fù)制能力的研究 HIV-1耐藥突變可能使病毒的酶活性受損，導(dǎo)致復(fù)制能力下降，但病毒也可能發(fā)生補償突變，彌補復(fù)制能力的損失。本研究的目的是闡明攜帶常見耐藥突變的HIV-1毒株的復(fù)制能力。我們采用平行培養(yǎng)的方法，將第二部分研究中構(gòu)建的病毒等量接種MT2細(xì)胞，在沒有藥物壓力的條件下培養(yǎng)10天，定期取培養(yǎng)上清接種TZM-bl細(xì)胞，48小時（hour, h）后測定熒光值，以野生型pNL4-3為參比，繪制病毒的復(fù)制動力學(xué)曲線，用具有一個重復(fù)測量的兩因素定量資料的假設(shè)檢驗方法對結(jié)果進行分析。 結(jié)果：（1）pNL4-3179/181/215復(fù)制能力在MT2細(xì)胞上最強，第三和四天分別提高71.69倍和132.94倍。（2）培養(yǎng)第五天后幾乎所有耐藥毒株的復(fù)制能力都高于野生毒株（2.21倍數(shù)-145.69倍）。（3）Y181C和H221Y突變均使pNL4-3179/215的復(fù)制能力在第6天和第7天顯著的提高（P=0.0066，P0.0001，P=0.0363，P0.0001），在pNL4-3103/215病毒攜帶的突變基礎(chǔ)上表現(xiàn)出相反的結(jié)果（P0.0001）。 結(jié)論：（1）首次發(fā)現(xiàn)攜帶突變V179E/Y181C/T215Y、V179E/H221Y/T215Y、V179E/T215Y、K103N/T215Y、K103N/Y181C/T215Y的復(fù)制能力強于野生毒株，可能與他們是NNRTIs耐藥突變有關(guān)。（2）復(fù)制能力的提高也可能是這些毒株耐藥的一個因素。（3）應(yīng)高度警惕高耐藥高復(fù)制的HIV-1毒株的流行，進行密切監(jiān)測。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.91

【參考文獻】

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本文編號：1529394