發(fā)布時(shí)間：2018-02-24 07:30

  本文關(guān)鍵詞： HIV-1 耐藥突變 基因型耐藥 表型耐藥 復(fù)制能力　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：我國(guó)艾滋病免費(fèi)抗病毒治療開(kāi)始于2003年，其覆蓋率到2011年9月底達(dá)到73.5%。隨著抗病毒治療時(shí)間的延長(zhǎng)，HIV-1感染者中抗病毒治療失敗的情況不斷出現(xiàn)，耐藥性毒株成為治療失敗的主要原因。我國(guó)艾滋病的抗病毒治療具有鮮明的特點(diǎn)，一是我國(guó)流行的HIV-1毒株以CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC及B亞型為主，與歐美等國(guó)以B亞型為主的情況顯著不同；二是使用的抗病毒藥物為國(guó)產(chǎn)仿制藥；三是采取鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療和疾控機(jī)構(gòu)統(tǒng)一發(fā)藥及管理病人的治療模式。這些特點(diǎn)使得我國(guó)HIV-1毒株的耐藥性具有自己的特點(diǎn)和規(guī)律。我國(guó)已經(jīng)開(kāi)展了HIV-1耐藥毒株的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，獲得了耐藥毒株的流行率、影響因素、對(duì)抗病毒治療的影響等一系列重要的數(shù)據(jù)。在抗病毒治療發(fā)展的過(guò)程中，不斷有突變被新鑒定為耐藥突變，新突變對(duì)HIV-1耐藥的影響、突變模式、突變之間的相互作用以及新突變對(duì)HIV-1毒株的復(fù)制能力的影響還沒(méi)有深入的研究。本課題首先對(duì)部分地區(qū)HIV-1感染者的基線耐藥和HIV-1抗病毒治療失敗后的耐藥情況進(jìn)行了分子流行病學(xué)研究。隨后對(duì)與抗病毒治療相關(guān)的突變及突變組合構(gòu)建了質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后利用重組病毒對(duì)我國(guó)常用抗病毒治療藥物進(jìn)行了耐藥表型檢測(cè)，并使用合適的方法分析了單一位點(diǎn)的作用和不同位點(diǎn)之間可能存在的相互作用。最后對(duì)攜帶相關(guān)突變組合的病毒株的復(fù)制能力進(jìn)行了研究。綜合全部研究結(jié)果，旨在掌握我國(guó)HIV-1耐藥毒株流行情況、闡明突變之間的相互作用及攜帶耐藥突變病毒的生物學(xué)特征，為臨床深入認(rèn)識(shí)HIV-1耐藥機(jī)理及耐藥病人的科學(xué)管理提供理論依據(jù)、為確保我國(guó)抗病毒治療效果提供實(shí)際指導(dǎo)。 第一部分我國(guó)部分地區(qū)HIV-1基因型耐藥的橫斷面研究 目前，耐藥HIV-1毒株在我國(guó)各地廣泛出現(xiàn)和流行，掌握耐藥毒株流行狀況是臨床有效治療病人的基礎(chǔ)。本部分研究旨在了解我國(guó)HIV-1耐藥毒株的分子流行病學(xué)特征，為進(jìn)一步研究和臨床抗病毒治療提供指導(dǎo)。我們收集2009年全國(guó)范圍內(nèi)8個(gè)省市的304例從未接受抗病毒治療的艾滋病患者的血漿標(biāo)本和2010年河南和河北兩省476例一線抗病毒治療失敗的艾滋病患者的血漿標(biāo)本，采用HIV-1基因型耐藥檢測(cè)方法進(jìn)行了基因型耐藥檢測(cè)，擴(kuò)增目的基因片段長(zhǎng)2.0kb，包含HIV-1蛋白酶的全部99個(gè)氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶的全部560個(gè)氨基酸，計(jì)算耐藥毒株流行率并分析耐藥相關(guān)的因素。 結(jié)果：（1）2010年河南省和河北省抗病毒治療失敗標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)成功321份，耐藥率高達(dá)67.6%，NRTIs和NNRTIs耐藥分別達(dá)到了54.21%（174/321）和65.42%（210/321）。NRTIs耐藥突變主要是TMAs突變和M184V；NNRTIs耐藥突變中以K103N和Y181C最為常見(jiàn)，其次是G190A/S和H221Y。Y181C和H221Y聯(lián)合突變?cè)诤颖笔『秃幽鲜〉哪退帢?biāo)本中分別占到23.33%（7/30）和16.58%（31/187），K103N/Y181C/H221Y在河北省和河南省耐藥標(biāo)本中分別占6.67%（2/30）和11.76%（22/187）。（2）未接受抗病毒治療的標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)成功269份，基線耐藥率為7.43%；深圳的基線耐藥為17.86%，顯著高于其他地區(qū)（χ2=4.9327, P=0.0264）；B亞型的基線耐藥顯著高于非B亞型（P=0.0177）；NNRTIs耐藥突變包括K103N、Y181C、V179D/E、G190E和K238N；PIs耐藥突變中包括能夠引起NFV高度耐藥的N88S、D30N和L90M。在這些標(biāo)本中，新報(bào)道的HIV-1流行重組毒株CRF55_01B在2009年廣州和深圳的男男性行為人群中的流行率為9.84%。 結(jié)論：受到樣本量和標(biāo)本保存的影響，部分地區(qū)的擴(kuò)增成功率較低，可能對(duì)結(jié)果有影響。本研究提供了部分地區(qū)抗病毒治療失敗耐藥和基線耐藥的概貌。河南和河北抗病毒治療失敗標(biāo)本中耐藥毒株的流行率非常高，嚴(yán)重地影響后續(xù)抗病毒治療效果。HIV-1基線耐藥的流行受到地區(qū)和病毒亞型的影響。近年來(lái)增長(zhǎng)的男男性行為人群中HIV-1的流行亞型更為復(fù)雜。跟蹤基線耐藥病人的抗病毒治療效果有助于闡明基線耐藥對(duì)抗病毒治療的影響。 第二部分HIV-1特定基因突變的耐藥性鑒定 HIV-1的耐藥突變十分復(fù)雜，截止到2008報(bào)道的突變已經(jīng)達(dá)到200多個(gè)，且不斷有新的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在藥物選擇壓力下，一些病毒基因的天然多態(tài)性位點(diǎn)很容易轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幭嚓P(guān)突變位點(diǎn)。目前，主要耐藥突變位點(diǎn)的作用已經(jīng)清楚，但對(duì)很多新出現(xiàn)的和由多態(tài)性位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槎鴣?lái)的突變的耐藥作用及其與主要突變之間的相互作用尚不明確。我國(guó)流行的HIV-1毒株亞型顯著不同于歐美國(guó)家，且我國(guó)采用獨(dú)特的國(guó)產(chǎn)仿制藥群體性治療的模式，，耐藥突變的發(fā)生和流行具有鮮明的特點(diǎn)。本研究的目的是闡明在我國(guó)接受抗病毒治療的艾滋病患者中廣泛流行的H221Y對(duì)耐藥的作用及其與其他突變的相互作用。我們從3名臨床耐藥的艾滋病患者血漿標(biāo)本中擴(kuò)增獲得含有不同耐藥突變組合（K103N/Y181C/H221Y/T215Y、V179E/Y181C/H221Y/T215Y、K101Q/Y181C/H221Y）的3段HIV-1pol區(qū)基因，以HIV-1pNL4-3為骨架構(gòu)建重組病毒。以此為基礎(chǔ)，對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變或回復(fù)突變、轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（Humanembryonic kidney，HEK293T），收獲病毒，構(gòu)建含有不同突變組合的21株病毒，在MT2細(xì)胞上對(duì)病毒進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，測(cè)定感染性滴度（50%tissue cultureinfectious dose，TCID50），在TZM-bl細(xì)胞上測(cè)定這些病毒對(duì)4種抗HIV藥物的敏感性，以pNL4-3病毒上定點(diǎn)突變的3株病毒作為參比。每種藥物設(shè)11個(gè)濃度梯度、2復(fù)孔、重復(fù)3次，計(jì)算50%抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50），采用析因設(shè)計(jì)的分析方法計(jì)算各個(gè)突變對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)及突變之間的相互作用。 結(jié)果：（1）K103N/T215Y顯著提高EFV對(duì)病毒的IC50（88.98-fold），V179E/T215Y、Y181C和K101Q分別使EFV對(duì)病毒的IC50提高18.46-fold、6.12-fold和6.76-fold，H221Y單一突變幾乎不影響EFV的IC50值（1.41-fold）。分別使EFV的IC50提高88.98-fold和18.46-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y聯(lián)合突變均與H221Y無(wú)交互作用，而分別使EFV的IC50提高6.12-fold和6.76-fold的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用（F=12.49，P=0.0028；F=28.10，P0.0001）。H221Y可拮抗K101Q對(duì)EFV的耐藥作用，使其相對(duì)于野生型的IC50由提高6.76-fold降低到二者相當(dāng)。（2）K103N/T215Y和V179E/T215Y均顯著提高AZT對(duì)病毒的IC50（30.66-fold，13.72-fold）。Y181C顯著的降低了AZT對(duì)病毒的IC50（0.335-fold）。H221Y對(duì)IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。分別使AZT的IC50提高30.66-fold和13.72-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y聯(lián)合突變均與H221Y無(wú)交互作用，而分別使AZT的IC50改變0.335-fold和1.50-fold的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用（F=18.71，P=0.0051；F=10.53，P=0.0011）。H221Y可拮抗Y181C對(duì)AZT的耐藥作用，使其相對(duì)于野生型的IC50由降低0.335-fold提高到二者相當(dāng)。（3）K101Q單一位點(diǎn)使3TC對(duì)病毒的IC50降低0.48-fold，K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C對(duì)3TC的IC50幾乎沒(méi)有影響（1.35-fold、0.80-fold、1.29-fold）。H221Y對(duì)IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。H221Y可拮抗K101Q對(duì)3TC的耐藥作用，H221Y與V179E/T215Y有顯著的拮抗作用。K101Q、K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C均不會(huì)使d4T的IC50顯著改變，H221Y單一位點(diǎn)顯著提高d4T對(duì)病毒的IC50（4.71-fold）。181和221之間不存在交互作用（P=0.9708）。 結(jié)論：（1）我們首次采用析因分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法及分析檢驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)了221單一位點(diǎn)突變對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)及與其他位點(diǎn)的交互作用。（2）H221Y單一位點(diǎn)對(duì)d4T的耐藥顯著提高，對(duì)EFV的耐藥提高較小，對(duì)AZT和3TC的作用隨著一起出現(xiàn)的突變位點(diǎn)而不同。（3）Y181C單一位點(diǎn)顯著提高AZT的敏感性。（4）基礎(chǔ)突變分別對(duì)EFV和AZT耐藥的影響顯著時(shí)，H221Y單一位點(diǎn)對(duì)耐藥的作用及與基礎(chǔ)位點(diǎn)之間的交互作用不顯著。 第三部分?jǐn)y帶耐藥相關(guān)突變的HIV-1毒株的復(fù)制能力的研究 HIV-1耐藥突變可能使病毒的酶活性受損，導(dǎo)致復(fù)制能力下降，但病毒也可能發(fā)生補(bǔ)償突變，彌補(bǔ)復(fù)制能力的損失。本研究的目的是闡明攜帶常見(jiàn)耐藥突變的HIV-1毒株的復(fù)制能力。我們采用平行培養(yǎng)的方法，將第二部分研究中構(gòu)建的病毒等量接種MT2細(xì)胞，在沒(méi)有藥物壓力的條件下培養(yǎng)10天，定期取培養(yǎng)上清接種TZM-bl細(xì)胞，48小時(shí)（hour, h）后測(cè)定熒光值，以野生型pNL4-3為參比，繪制病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線，用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素定量資料的假設(shè)檢驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果：（1）pNL4-3179/181/215復(fù)制能力在MT2細(xì)胞上最強(qiáng)，第三和四天分別提高71.69倍和132.94倍。（2）培養(yǎng)第五天后幾乎所有耐藥毒株的復(fù)制能力都高于野生毒株（2.21倍數(shù)-145.69倍）。（3）Y181C和H221Y突變均使pNL4-3179/215的復(fù)制能力在第6天和第7天顯著的提高（P=0.0066，P0.0001，P=0.0363，P0.0001），在pNL4-3103/215病毒攜帶的突變基礎(chǔ)上表現(xiàn)出相反的結(jié)果（P0.0001）。 結(jié)論：（1）首次發(fā)現(xiàn)攜帶突變V179E/Y181C/T215Y、V179E/H221Y/T215Y、V179E/T215Y、K103N/T215Y、K103N/Y181C/T215Y的復(fù)制能力強(qiáng)于野生毒株，可能與他們是NNRTIs耐藥突變有關(guān)。（2）復(fù)制能力的提高也可能是這些毒株耐藥的一個(gè)因素。（3）應(yīng)高度警惕高耐藥高復(fù)制的HIV-1毒株的流行，進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R512.91

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1529394