本文關(guān)鍵詞： 瘧疾 肝細(xì)胞 自噬 IFN-γ　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：當(dāng)前瘧疾依然是世界上危害最為嚴(yán)重的三大傳染病之一,瘧疾的病原體是瘧原蟲,其生活史主要包括肝期、紅內(nèi)期和蚊期。肝期是瘧原蟲感染宿主的始動時期,若能阻斷肝期感染則能從源頭上控制瘧疾。揭示肝期瘧原蟲與宿主細(xì)胞相互作用及其逃避或抑制宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制將為研究新的肝期瘧原蟲阻斷策略提供新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。而由于按蚊飼養(yǎng)及感染平臺的限制,目前對于肝期瘧原蟲與宿主細(xì)胞相互作用機(jī)制仍然知之甚少�，F(xiàn)有的研究認(rèn)為肝期瘧原蟲入侵宿主肝細(xì)胞后,子孢子表面環(huán)子孢子蛋白CSP(circumsporozoite protein)能夠脫落并被水解成為ΔCSP,ΔCSP溢出納蟲空泡進(jìn)入肝細(xì)胞胞漿則促進(jìn)瘧原蟲在肝細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育。但其具體機(jī)制并不清楚。而本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組CSP或ΔCSP質(zhì)粒并不能夠直接顯著地促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲EEF(Exo-erythrocytic Forms)的發(fā)育,卻能夠顯著地抑制IFN-γ對胞內(nèi)EEF的殺傷作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染重組ΔCSP質(zhì)粒能夠抑制肝細(xì)胞自身自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。而目前尚不清楚宿主肝細(xì)胞自身自噬是否參與調(diào)節(jié)肝期瘧原蟲EEF的生長發(fā)育以及IFN-γ對肝細(xì)胞內(nèi)EEF的殺傷作用。因此,為了解釋這一現(xiàn)象,本研究在該研究基礎(chǔ)之上從體內(nèi)體外進(jìn)一步證實(shí)了ΔCSP對肝期瘧原蟲EEF的生長發(fā)育、IFN-γ殺傷EEF作用及宿主肝細(xì)胞自身自噬水平的影響;探討了宿主肝細(xì)胞自身自噬水平對肝期瘧原蟲EEF的生長發(fā)育、IFN-γ殺傷EEF作用的影響;隨后借助CSP pexel功能域突變子孢子以及肝細(xì)胞ATG5條件敲除小鼠來驗證體外實(shí)驗結(jié)果;最后通過eXact-His雙標(biāo)簽純化系統(tǒng)及蛋白質(zhì)譜技術(shù),初步探討了ΔCSP下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的具體分子機(jī)制�？蔀樵O(shè)計新的瘧疾肝期阻斷策略提供新的靶點(diǎn)及立論依據(jù)。一、ΔCSP對肝期瘧原蟲發(fā)育、IFN-γ殺傷EEF及肝細(xì)胞自噬的影響:1、轉(zhuǎn)染重組CSP或ΔCSP并不能顯著促進(jìn)肝期EEF的生長發(fā)育:通過構(gòu)建并轉(zhuǎn)染重組CSP及ΔCSP質(zhì)粒至HepG2-CD81細(xì)胞,隨后感染P.yoelii 265BY子孢子,感染42h后采用探針定量q-PCR實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲蟲荷進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染重組CSP或ΔCSP質(zhì)粒并不能顯著促進(jìn)肝期EEF的生長發(fā)育。2、轉(zhuǎn)染重組csp或Δcsp能夠顯著抑制ifn-γ對肝期eef的殺傷作用:在轉(zhuǎn)染重組csp及Δcsp質(zhì)粒至hepg2-cd81細(xì)胞之后,加入1u/mlifn-γ進(jìn)行處理,感染24h后分別采用間接免疫熒光實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)eef直徑、大小、lc3共聚率和lamp-1共聚率進(jìn)行統(tǒng)計分析,以及42h后采用探針定量q-pcr實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲蟲荷進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染重組csp或Δcsp質(zhì)粒組eef的直徑、大小并不受ifn-γ影響,說明Δcsp能夠抑制ifn-γ對eef的殺傷作用。3、轉(zhuǎn)染重組csp或Δcsp能夠顯著抑下調(diào)肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平:為了探討Δcsp抑制ifn-γ殺傷eef作用的機(jī)制,本研究通過轉(zhuǎn)染重組csp及Δcsp質(zhì)粒至hepg2-cd81細(xì)胞之后,分時間點(diǎn)0h,6h,12h和24h裂解細(xì)胞,通過westernblot實(shí)驗對自噬相關(guān)蛋白lc3、atg7、beclin-1及p62(sqstm1)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:隨著時間推移,轉(zhuǎn)染Δcsp重組質(zhì)粒后lc3及atg7蛋白水平顯著降低,p62則出現(xiàn)一定積累,說明轉(zhuǎn)染Δcsp重組質(zhì)�？梢悦黠@抑制hepg2-cd81細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。二、自噬對肝期瘧原蟲發(fā)育及ifn-γ殺傷作用的影響:1、肝細(xì)胞條件敲除atg5限制肝細(xì)胞內(nèi)eef生長發(fā)育:為了探討肝細(xì)胞自噬對eef生長發(fā)育的影響,本研究通過過雜交構(gòu)建了肝細(xì)胞atg5條件敲除小鼠,隨后采用尾靜脈注射感染p.yoelii265by子孢子。42h后,取小鼠肝臟病對其蟲荷進(jìn)行探針定量q-pcr檢測,結(jié)果顯示當(dāng)肝細(xì)胞atg5條件性缺失的時候,肝細(xì)胞內(nèi)eef生長發(fā)育受到限制,提示肝期瘧原蟲的發(fā)育需要肝細(xì)胞自噬參與,但其分子機(jī)制并不清楚。2、促進(jìn)或抑制肝細(xì)胞自身自噬水平卻不能顯著影響肝期eef發(fā)育:為了探討自噬參與調(diào)節(jié)肝期瘧原蟲發(fā)育的機(jī)制,本研究采用了自噬促進(jìn)劑rapamycin和自噬抑制劑ly294002處理分別調(diào)節(jié)hepg2-cd81細(xì)胞自噬水平,隨后加入p.yoelii265by子孢子感染,感染24h后分別采用間接免疫熒光實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)eef直徑、大小、lc3共聚率和lamp-1共聚率進(jìn)行統(tǒng)計分析,以及42h后采用探針定量q-pcr實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲蟲荷進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:無論rapamycin或者ly294002調(diào)解肝細(xì)胞自噬后都無法對eef的直徑、大小產(chǎn)生影響,探針定量q-pcr實(shí)驗結(jié)果也獲得了同樣的結(jié)果。3、促進(jìn)或抑制肝細(xì)胞自身自噬水平卻能顯著影響ifn-γ對eef的殺傷作用:以上體內(nèi)體外的實(shí)驗得到了不同的結(jié)果,而其不同點(diǎn)在于體內(nèi)有ifn-γ存在,而體外并沒有。為了探討肝細(xì)胞自噬水平對ifn-γ殺傷eef能力的影響,本研究在使用自噬促進(jìn)劑rapamycin和自噬抑制劑ly294002處理分別調(diào)節(jié)hepg2-cd81細(xì)胞自噬水平的同時,加入了ifn-γ對eef進(jìn)行殺傷,同樣在感染24h后分別采用間接免疫熒光實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)eef直徑、大小、lc3共聚率和lamp-1共聚率進(jìn)行統(tǒng)計分析,以及42h后采用探針定量q-pcr實(shí)驗對肝細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲蟲荷進(jìn)行分析。結(jié)果顯示:rapamycin促進(jìn)肝細(xì)胞自噬水平后能夠顯著促進(jìn)0.2u/mlifn-γ的殺傷作用,ly294002抑制肝細(xì)胞自噬水平后卻能夠顯著抑制0.5u/ml和1u/ml對eef的殺傷作用。結(jié)果說明調(diào)節(jié)肝細(xì)胞自噬水平能夠顯著影響ifn-γ對eef的殺傷。4、肝細(xì)胞條件敲除atg5使ifn-γ失去殺傷eef的能力隨后對該現(xiàn)象進(jìn)行了體內(nèi)驗證,對肝細(xì)胞條件敲除小鼠atg5腹腔注射拮抗抗體中和體內(nèi)ifn-γ作用,隨后尾靜脈注射感染p.yoelii265by子孢子,感染42h后,采用探針定量q-pcr對小鼠肝臟內(nèi)蟲荷進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:使用拮抗抗體中和ifn-γ后的小鼠肝臟蟲荷與未拮抗組并無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異,說明肝細(xì)胞完全缺失自噬情況下,ifn-γ也無法發(fā)揮殺傷eef的功能。三、Δcsp下調(diào)自噬相關(guān)蛋白抑制ifn-γ對eef的殺傷作用:1、共轉(zhuǎn)染atg3/5/7能夠恢復(fù)被Δcsp抑制的ifn-γ的殺傷作用:前期的研究結(jié)果顯示抑制肝細(xì)胞自噬水平能夠抑制ifn-γ對eef的殺傷作用。為了探討Δcsp抑制肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平與其抑制ifn-γ殺手作用的關(guān)系,本研究構(gòu)建了重組atg3/5/7質(zhì)粒,并與Δcsp共轉(zhuǎn)染至hepg2-cd81細(xì)胞,隨后加入p.yoelii265by子孢子感染,42h后采用探針定量q-pcr對細(xì)胞內(nèi)的蟲荷進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示:共轉(zhuǎn)染atg3/5/7能不同程度的恢復(fù)被Δcsp抑制的ifn-γ殺傷作用。2、構(gòu)建csppexel功能域突變子孢子:體外的研究結(jié)果顯示:csp可能通過下調(diào)自噬相關(guān)蛋白從而抑制ifn-γ對eef的殺傷作用。由于csp蛋白對子孢子的發(fā)育成熟非常關(guān)鍵,缺失csp的子孢子將無法存活。為了從生理狀態(tài)下驗證這一結(jié)果,本研究通過crispr-cas9技術(shù)構(gòu)建了csp無法溢出納蟲空泡的csppexel功能域突變的p.yoelii265by子孢子。下一步將在拮抗或不拮抗ifn-γ情況下進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗,探討生理狀態(tài)確實(shí)csp進(jìn)入胞漿對ifn-γ殺傷作用的影響。四、Δcsp下調(diào)自噬相關(guān)蛋白的機(jī)制初探:1、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)exact-his雙標(biāo)簽Δcsp的hepg2-cd81細(xì)胞系:為了深入探討Δcsp下調(diào)hepg2-cd81細(xì)胞的具體分子機(jī)制。本研究利用慢病毒感染的方式構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)exact-his雙標(biāo)簽Δcsp的hepg2-cd81細(xì)胞系。2、串聯(lián)質(zhì)譜分析HepG2-CD81細(xì)胞中可能與ΔCSP直接相互作用的蛋白:將1×10~7穩(wěn)定表達(dá)eXact-His雙標(biāo)簽ΔCSP的HepG2-CD81細(xì)胞與對照空質(zhì)粒病毒感染的細(xì)胞分別裂解,并通過Profinity eXact Purification Resin(Bio-rad)和Ni-NTA Agarose(Qiagen)的兩次純化后,對洗脫液進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗。結(jié)果顯示:ΔCSP可能通過與HSPA8作用下調(diào)細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。本研究首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組子孢子ΔCSP質(zhì)�？梢砸种艻FN-γ殺傷EEF,并可以抑制肝細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)水平。而ΔCSP可能通過HSPA8下調(diào)自噬相關(guān)蛋白ATG的表達(dá)水平從而抑制了IFN-γ的殺傷作用。肝期是瘧疾感染的始動時期,并無臨床癥狀,若能將瘧原蟲感染阻斷在肝期則能從源頭上控制住瘧疾的感染。因此深入揭示肝期瘧原蟲與宿主細(xì)胞相互作用及其逃避或抑制宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制將為研究新的肝期瘧原蟲阻斷策略提供新的靶點(diǎn)及理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R531.3

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本文編號：1482270