本文關(guān)鍵詞：腦微血管內(nèi)皮細胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的分子機制及結(jié)核分枝桿菌跨越血腦屏障體外模型的初步研究　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核性腦膜炎 結(jié)核分枝桿菌 血腦屏障 腦微血管內(nèi)皮細胞 細胞毒性 細胞內(nèi)運輸

【摘要】：結(jié)核性腦膜炎主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起,是結(jié)核病最嚴(yán)重的一種形式,主要發(fā)生于幼兒和HIV感染病人,具有高致死率的特點。結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生是由于結(jié)核分枝桿菌隨血液循環(huán)到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致,而中樞神經(jīng)系統(tǒng)由腦微血管內(nèi)皮細胞構(gòu)成的血腦屏障保護。盡管體內(nèi)和體外實驗研究均表明結(jié)核分枝桿菌可以跨越血腦屏障。但是,結(jié)核分枝桿菌跨越血腦屏障的細胞和分子機制仍然不清楚。本研究以分枝桿菌為研究對象,以腦微血管內(nèi)皮細胞為模型,通過研究分枝桿菌與細胞相互作用及構(gòu)建血腦屏障體外模型,以期解釋腦微血管內(nèi)皮細胞在抗分枝桿菌感染在中的作用及分枝桿菌跨越血腦屏障的機制。主要內(nèi)容如下:1.分枝桿菌感染鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的受體分析。為了研究CD44在分枝桿菌感染鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中的作用,我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染細胞,在特定時間點進行透射電子顯微鏡,激光共聚焦掃描顯微鏡和流式細胞儀器檢測及采用CD44中和抗體進行阻斷分析。透射電子顯微鏡結(jié)果顯示牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv均可感染并內(nèi)化到鼠腦微血管內(nèi)皮細胞吞噬泡內(nèi),并且二者之間沒有顯著性差異。激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果顯示CD44表達在腦微血管內(nèi)皮細胞表面,而細胞質(zhì)內(nèi)也有少量的CD44表達。同時,我們發(fā)現(xiàn)CD44可以募集到分枝桿菌感染位點,但是,CD44的表達不受分枝桿菌感染的影響。然而,CD44中和抗體不能阻斷分枝桿菌感染并內(nèi)化到鼠腦微血管內(nèi)皮細胞內(nèi)。以上結(jié)果說明分枝桿菌可以感染并內(nèi)化到鼠腦微血管內(nèi)皮細胞,但CD44不參與這一過程。2.分枝桿菌在鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中存活的分析。為了研究分枝桿菌是否在鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中繁殖,我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染細胞,在特定時間點進行胞內(nèi)存活實驗及顯微鏡計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在無抗生素的條件下結(jié)合及內(nèi)化到細胞內(nèi)的牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌H37Rv數(shù)量先降低而后升高,但當(dāng)在抗生素存在的條件下二者在細胞內(nèi)的活菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著性下降的趨勢。在不同時間點取細胞培養(yǎng)上清進行細菌計數(shù),發(fā)現(xiàn)在無抗生素的條件下牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv均可在培養(yǎng)上清中繁殖,但是在抗生素存在條件下則檢測不到活菌的存在。此外,我們也用顯微鏡計數(shù)進行進一步的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗生素存在情況下,隨著時間延長,細胞感染的百分比,包含10個以上細菌的細胞數(shù)及細菌總數(shù)均呈現(xiàn)下降的趨勢。以上結(jié)果說明牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv不能在鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中繁殖。3.分枝桿菌感染對鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的影響。為了研究是否分枝桿菌感染對鼠腦微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生細胞毒性效應(yīng),我們用牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv感染細胞,在不同的時間點固定細胞進行顯微鏡觀察,測定ldh及統(tǒng)計臺盼蘭陽性細胞的百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv感染及在細胞中的持續(xù)存在均不破壞鼠腦微血管內(nèi)皮細胞單層細胞結(jié)構(gòu)。另外,感染細胞ldh的釋放量及臺盼蘭陽性細胞的數(shù)量也沒有顯著性上升。說明分枝桿菌感染和持續(xù)存在不對鼠腦微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生細胞毒性效應(yīng)。4.分枝桿菌在鼠腦微血管內(nèi)皮細胞中的運輸分析。為了研究是否分枝桿菌被鼠腦微血管內(nèi)皮細胞降解,從而不能在該細胞中繁殖。我們分別用牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv感染鼠腦微血管內(nèi)皮細胞,并用吞噬體特異性分子,rab5和rab7,及溶酶體特異性分子,lamp2和cathepsinl細胞并進行激光共聚焦顯微鏡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv吞噬體均可以被rab5,rab7,lamp2和cathepsinl分別標(biāo)記,并且隨著時間的延長被rab5標(biāo)記的吞噬體的數(shù)量顯著性降低,被rab7和lamp2共同標(biāo)記的吞噬體則顯著性上升,說明包含分枝桿菌的吞噬體成熟為吞噬溶酶體。另外,牛分枝桿菌bcg可以被cathepsinl強標(biāo)記,但是結(jié)核分枝桿菌h37rv則不能,說明后者可以延緩?fù)淌扇苊阁w的酸化。以上結(jié)果說明分枝桿菌吞噬體成熟為吞噬溶酶體,進而被細胞降解。5.分枝桿菌逃逸到鼠腦微血管內(nèi)皮細胞質(zhì)的分析。為了研究分枝桿菌是否可以逃逸到細胞質(zhì),從而躲避腦微血管內(nèi)皮細胞的快速殺傷作用,我們用spioc18和phalloidin共同標(biāo)記細胞后進行激光共聚焦顯微鏡分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的結(jié)核分枝桿菌h37rv不能被spioc18進行標(biāo)記,而牛分枝桿菌bcg則不能,說明該毒力菌株具有逃逸到細胞質(zhì)的能力。最后,我們檢測了結(jié)核分枝桿菌h37rv是否可以逃出細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)沒有抗生素的情況下牛分枝桿菌bcg和結(jié)核分枝桿菌h37rv感染細胞可以形成菌落簇,而當(dāng)抗生素存在的情況下菌落簇則消失,說明二者均不能逃出細胞。以上結(jié)果說明結(jié)核分枝桿菌h37rv通過逃逸到細胞質(zhì)而逃避細胞的快速殺傷作用,但是細胞質(zhì)內(nèi)的細菌則不能逃出細胞。6.分枝桿菌在人腦微血管內(nèi)皮細胞和人星形膠質(zhì)細胞中的存活分析。為了研究分枝桿菌是否在人腦微血管內(nèi)皮細胞和人星形膠質(zhì)細胞中繁殖,我們分別用牛分枝桿菌BCG和結(jié)核分枝桿菌毒力菌株H37Rv感染細胞,在特定時間點進行胞內(nèi)存活實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗生素存在的條件下,人腦微血管內(nèi)皮細胞和人星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的分枝桿菌活菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著性下降的趨勢。此外,我們發(fā)現(xiàn)二者也不能逃出細胞并感染臨近細胞。以上的結(jié)果說明分枝桿菌不能在人腦微血管內(nèi)皮細胞和人星形膠質(zhì)細胞中繁殖,同時也不能逃出感染細胞。7.分枝桿菌跨越血腦屏障雙層細胞模型的分析。為了研究是否分枝桿菌跨越血腦屏障通過細胞間隙途徑及外周血單核細胞在分枝桿菌跨越血腦屏障中的作用,我們用人腦微血管內(nèi)皮細胞和人星形膠質(zhì)細胞構(gòu)建了血腦屏障體外模型,分別用游離的分枝桿菌和感染了分枝桿菌的巨噬細胞感染血腦屏障體外模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌毒力菌株H37Rv可以跨越該血腦屏障體外模型,同時,伴隨著該屏障結(jié)構(gòu)通透性的改變,表現(xiàn)為TEER的顯著性降低和對Na-F通透性的增強。然而,牛分枝桿菌BCG則不能跨越該屏障結(jié)構(gòu)。有意思的是,包含細菌的巨噬細胞感染血腦屏障后可以引起通透性的改變,但是只有毒力菌株可以跨越血腦屏障。以上結(jié)果說明結(jié)核分枝桿菌跨越血腦屏障可能通過細胞間隙并伴隨著血腦屏障通透性的改變,而單核細胞也可能在此過程中發(fā)揮著作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R529.3

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