本文關(guān)鍵詞：益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌致腦膜炎的初步研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：一、研究背景和目的阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii,CS),隸屬于腸桿菌科,是寄生在人和動物腸道內(nèi)的一種有周生鞭毛,能運動,兼性厭氧的革蘭陰性無芽孢桿菌。該菌主要引起嬰幼兒,尤其是早產(chǎn)兒發(fā)生腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎的感染,死亡率高達40%-80%,感染的幸存者易造成嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。自1961年報道了2例由克羅諾桿菌引起的腦膜炎病例,以后相繼在世界范圍內(nèi)報道了一系列新生兒感染事件。2004年我國安徽阜陽劣質(zhì)嬰幼兒配方奶粉事件引起政府的高度重視,并且首次從87份嬰幼兒配方奶粉中分離到11株該菌,檢出率達12.6%,小孩出現(xiàn)頭部腫大和反應(yīng)遲鈍,可能該菌在致病中起到重要作用。目前氨芐青霉素聯(lián)合慶大霉素或者氯霉素是治療克羅諾桿菌感染的金標準。但抗生素的廣泛應(yīng)用,有其必然的危害：1)抗感染藥物治療容易導(dǎo)致人體微生態(tài)平衡失調(diào)；2)產(chǎn)生耐藥性；3)絕大多數(shù)抗感染藥物是針對微生物設(shè)計而相對忽略了宿主在抗感染中的主導(dǎo)作用。因此補充和替代抗生素治療的藥物和方法研究也越來越受到關(guān)注。目前阪崎克羅諾桿菌如何通過腸屏障造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染,仍不清楚,但在新生兒腦膜炎的發(fā)生過程中,阪崎克羅諾桿菌首先定植于新生兒腸道,之后才會穿透腸屏障和血腦屏障,引起菌血癥和腦膜炎,所以預(yù)防阪崎克羅諾桿菌穿透腸上皮細胞入血,也成為有效預(yù)防其引發(fā)菌血癥和腦膜炎的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在此基礎(chǔ)上,益生菌常作為預(yù)防和抗菌治療的補充或替代,尤其在防、治各種致病菌與條件致病菌在腸道的黏附、侵襲和生長繁殖方面發(fā)揮了極大優(yōu)勢。益生菌又稱為微生態(tài)制劑或活菌制劑,根據(jù)2003年歐洲食品與飼料協(xié)會的定義,益生菌指當攝入充足數(shù)量后,能對宿主產(chǎn)生一種或多種已被證實有功能性健康益處的活的微生物,主要包括乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、丙酸菌、芽孢桿菌屬、酵母菌等。研究證實益生菌可預(yù)防和治療多種感染性疾病,其機制主要包括：直接與致病微生物相互作用,通過替代、排斥和競爭機制抑制致病菌生長和黏附定植；調(diào)節(jié)腸道微生態(tài),促進內(nèi)環(huán)境共生穩(wěn)態(tài)；通過空間位點和營養(yǎng)競爭等阻斷其對腸黏膜誘導(dǎo)破壞和血行轉(zhuǎn)移,發(fā)揮其抗感染作用；誘導(dǎo)結(jié)腸Mucin基因表達的上調(diào),腸道黏膜表面粘蛋白的分泌增多,從而拮抗致病菌的粘附侵襲和跨細胞易位轉(zhuǎn)移。如將益生菌應(yīng)用于早期新生兒腦膜炎的預(yù)防或治療,可克服廣譜抗生素的諸多缺點。最近己有研究首次證明益生菌鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus GG, LGG)能抑制E coli Kl株在新生大鼠腸道黏附與入侵,從而顯著降低菌血癥與腦膜炎發(fā)生率。但是益生菌是否能夠抑制阪崎克羅諾桿菌黏附與入侵,從而降低菌血癥與腦膜炎發(fā)生率,目前仍不清楚。本研究選擇鼠李糖乳桿菌和新型益生菌脆弱擬桿菌作為研究對象。其中LGG是從健康人腸道分離出的1株乳桿菌,是人類研究最廣泛的益生菌之一。它能生活在胃腸道,且黏著率高,定植能力強,并具有高效降膽固醇,促進細胞分裂,調(diào)節(jié)和平衡腸道菌群功能,加強對感染的自然防御,對改善多種腸道疾病有積極作用。脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis, BF)是人體常見的厭氧菌,無芽孢、無動力,有產(chǎn)腸毒素和不產(chǎn)腸毒素兩大類。產(chǎn)腸毒素的菌株研究較多,可能會導(dǎo)致人和動物發(fā)生腹瀉,而不產(chǎn)腸毒素的脆弱擬桿菌能在人體腸道定植。對兒童有促進生長發(fā)育和提高免疫力的作用,可增強腸上皮細胞的屏障功能,對消化道和呼吸道某些常見病和多發(fā)病有明顯的治療效果,是一種新型活體生物制劑,有消除腸道炎癥的作用、治療腹瀉、自閉癥等功能。綜上,本研究的主要目的：評價鼠李糖乳桿菌(LGG)和分離自某健康足月新生兒糞便的脆弱擬桿菌(BF SK08)兩種益生菌能否抑制阪崎克羅諾桿菌黏附和侵襲小腸上皮細胞(Caco-2),從而預(yù)防和治療克羅諾桿菌引起的菌血癥和腦膜炎。(1)體外利用Caco-2細胞模型,檢測阪崎克羅諾桿菌對Caco-2細胞的黏附、侵襲性及兩種益生菌對Caco-2細胞的黏附性能。(2)采用競爭排斥置換法,探討兩種益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌黏附侵襲Caco-2細胞的作用,確定益生菌黏附抑制阪崎克羅諾桿菌侵襲Caco-2細胞的方式。(3)運用western blot驗證兩種益生菌對主要粘蛋白基因MUC-2表達的調(diào)節(jié)作用,益生菌能否拮抗阪崎克羅諾桿菌誘導(dǎo)的粘蛋白基因表達下降,發(fā)揮其拮抗致病菌黏附侵襲作用。(4)益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌腸道血源性轉(zhuǎn)移的新生大鼠模型建立及預(yù)防、治療試驗。通過以上研究,觀察鼠李糖乳桿菌LGG和新型脆弱擬桿菌SK08兩種益生菌能否抑制阪崎克羅諾桿菌引起的菌血癥和腦膜炎,初步探討益生菌抑制致病菌的黏附、侵襲和預(yù)防血行轉(zhuǎn)移入腦是否與調(diào)節(jié)腸道粘液蛋白基因表達相關(guān)。二、研究方法1、體外阪崎克羅諾桿菌黏附、侵襲實驗體外利用小腸上皮細胞Caco-2作為黏附侵襲檢測對象,具體方法為；感染前接種Caco-2細胞,待長至單層(約105),細菌接種物用不含抗生素的培養(yǎng)基重懸。以每孔1×107的細菌量放入培養(yǎng)Caco-2細胞的24孔板內(nèi)(使細胞感染倍數(shù)為100),在37℃,5%C02培養(yǎng)箱中共同孵育90 min。為了計算黏附細胞的細菌數(shù),細胞用培養(yǎng)基洗3次,加入100μL 0.5% Triton X-100裂解細胞,孵育8 mmin后,立即加入50μL蒸餾水。在溶解細胞之前的孵育和清洗階段,單層細胞盡量要保持完整。反復(fù)吹打后吸出樣品,做梯度稀釋(10-2-10-4)后涂苯唑西林和氨芐西林抗性平板計數(shù)菌落數(shù)。黏附率=胞內(nèi)細菌數(shù)/孵育細菌數(shù)×100%,重復(fù)三次取平均值。對于侵襲實驗,以每孔1×107CFU的細菌量放入培養(yǎng)好Caco-2細胞的24孔板內(nèi)(使細胞感染倍數(shù)為100),在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中共同孵育90min。用培養(yǎng)基洗3次,再用含量為100μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)基孵育1 h,以殺死細胞外的細菌。用培養(yǎng)基洗3次,加入100μL 0.5% Triton X-100裂解細胞,孵育8 min后,立即加入50 μL蒸餾水,溶解細胞。反復(fù)吹打后吸出樣品做梯度稀釋(10-1-10-4)后,涂苯唑西林和氨芐西林抗性平板計數(shù)菌落數(shù)。侵襲率=胞內(nèi)細菌數(shù)/孵育細菌數(shù)×100%,或者相對侵襲率,重復(fù)三次取平均值。2、益生菌抑制阪崎克羅諾桿菌黏附、侵襲實驗參照文獻采用競爭排斥置換實驗,設(shè)置對照組和實驗組,對照組：Caco-2與ATCC 29544共孵育3h；實驗組分為3個不同處理組：(1)競爭組：Caco-2 +ATCC 29544+益生菌(BF SK08或LGG)共孵育3h；(2)置換組：Caco-2 +ATCC 29544共孵育1h,再加益生菌(BF SK08或LGG),繼續(xù)孵育2 h；(3)排斥組：Caco-2+益生菌(BF SK08或LGG)共孵育1 h,再加ATCC29544,繼續(xù)孵育2 h。實驗采用預(yù)先培養(yǎng)好的24孔板Caco-2細胞,細胞長到80%(大概105-106細胞量),用致病菌和益生菌按以上分組進行孵育,再用慶大霉素孵育1h, Triton-X 100裂解細胞,涂苯唑西林和氨芐西林抗性平板,培養(yǎng)24 h,計算黏附率、侵襲率。3、益生菌誘導(dǎo)腸上皮細胞MUC-2基因表達實驗分四個組,分別為益生菌組、益生菌+致病菌組、致病菌組和對照組,其中益生菌組分為Caco-2+BF SK08, Caco-2+LGG, Caco-2+LGG+BF SK08,益生菌+致病菌組分為Caco-2+BF SK08+ATCC 29544, Caco-2+LGG+ ATCC 29544, Caco-2+LGG+BF SK08+ ATCC 29544,致病菌組Caco-2+ ATCC 29544,對照組則為Caco-2細胞,細胞接種在細胞平皿中長至單層,按上述方法加入ATCC 29544,孵育3 h,將細胞懸液收集,提取蛋白,用Western blot法檢測益生菌和致病菌的誘導(dǎo)腸上皮細胞MUC-2的表達。4、阪崎克羅諾桿菌腸道血源性轉(zhuǎn)移的新生大鼠模型參考文獻,選擇Sprague Dawley乳鼠窩鼠16窩(約160只),2-3日齡,每組20只,分預(yù)防實驗和治療實驗,具體為：(1)預(yù)防實驗：窩鼠4窩,分為實驗組和對照組,實驗組2日齡分別灌胃BF SK08、LGG、BF SK08+LGG,劑量為108 CFU/只,連續(xù)灌胃2 d,對照組灌胃同等劑量PBS。3d(5日齡)后,所有鼠均灌胃劑量為108 CFU/只的ATCC 29544。2d后乳鼠處死,分別取腸道內(nèi)容物、血液、腦脊液,涂平板(苯唑西林和氨芐西林抗性平板或MRS)計數(shù)。(2)治療實驗：窩鼠4窩,分為實驗組和對照組,所有乳鼠2日齡灌胃劑量為108 CFU的ATCC 29544.3d(5日齡)后,實驗組小鼠分別灌胃BF SK08、LGG、BF SK08+LGG,劑量108 CFU/只,對照組灌胃同等劑量PBS。2d后乳鼠處死,分別取腸道內(nèi)容物、血液、腦脊液。涂板計數(shù)(同上)。三、結(jié)果1、阪崎克羅諾桿菌ATCC 29544對Caco-2細胞具有黏附、侵襲性。其中以大腸桿菌E44(E coli Kl株)作為陽性對照,DH5a為陰性對照,經(jīng)3h黏附后,其黏附作用比陽性對照組E44小(相對黏附率為31.3%),比陰性對照組DH5α大(P0.05)；待細菌黏附3h后,加入慶大霉素進行侵襲實驗檢測,結(jié)果顯示其侵襲作用與陽性對照組E44接近,比陰性對照組DH5a大(P0.05)。分別在1、3和5h時間點取培養(yǎng)板上細菌涂板,結(jié)果顯示阪崎克羅諾桿菌在感染細胞3h后對細胞的黏附性和侵襲性最大,隨著時間的推移,細菌的黏附能力有所下降(P0.05)。2、益生菌(鼠李糖乳桿菌LGG和脆弱擬桿菌SK08)抑制阪崎克羅諾桿菌黏附、侵襲Caco-2細胞,且呈劑量依賴性。分別用不同濃度(106,107,108)的BF SK08和LGG進行抑制ATCC 29544黏附、侵襲實驗,結(jié)果顯示隨著BF SK08和LGG濃度的增加,阪崎克羅諾桿菌的相對侵襲率明顯下降,說明侵入到Caco-2細胞中的致病菌明顯減少,抑制作用明顯(P0.05)。采用競爭排斥置換實驗,結(jié)果表明：與對照組相比,各實驗組侵襲率均降低(P0.05),而競爭和排斥組抑制作用比置換組大,排斥組的抑制作用比競爭組大,統(tǒng)計學(xué)具有顯著差異(P0.05),表明BF SK08和LGG兩種益生菌對抑制致病菌阪崎克羅諾桿菌4侵襲Caco-2細胞具有一定作用,同時間接指導(dǎo)益生菌的預(yù)防效果強于治療效果。3、用WB法對益生菌拮抗致病菌黏附侵襲的機制進行了初步研究,提取各組細胞總蛋白,采用β-actin做內(nèi)參,WB法檢測益生菌和致病菌誘導(dǎo)腸上皮細胞Caco-2的Mucin基因的表達。結(jié)果顯示加入益生菌的Caco-2細胞MUC-2基因明顯上調(diào),而未加入益生菌組的MUC-2基因表達則顯著降低,共同加入益生菌和致病菌的組則基因表達無明顯變化,說明益生菌誘導(dǎo)的MUC-2基因表達上調(diào)可能成為其拮抗致病菌的保護機制之一。MUC-2隨著機體的病理性的改變而發(fā)生變化,會出現(xiàn)黏蛋白表達的異常包括黏蛋白的基因水平及其蛋白質(zhì)水平的改變,硫基化程度的降低、糖基化和蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)的改變,從而影響他們的保護功能的發(fā)揮,導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本實驗闡明MUC-2基因在人體結(jié)腸癌細胞中的生物學(xué)功能和進一步研究該基因與益生菌、致病菌之間存在一定關(guān)系。說明益生菌對致病菌黏附附侵襲腸上皮細胞的抑制作用離不開宿主本身攜帶的MUC-2基因的保護作用。4、在阪崎克羅諾桿菌腸道血源性轉(zhuǎn)移的新生大鼠中,同時設(shè)置預(yù)防組和治療組,48 h后取腸道內(nèi)容物、血液、腦脊液標本檢測。結(jié)果顯示,預(yù)防組和治療組中,益生菌+致病菌組乳鼠腸道定植的阪崎克羅諾桿菌數(shù)量顯著少于對照組(P0.05),未發(fā)生菌血癥,腦脊液中也未檢測到ATCC 29544株。對照組灌胃致病菌(108CFU)后,預(yù)防組20只乳鼠中20只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL),14只腦脊液中出現(xiàn)ATCC 29544株。治療組20只乳鼠中20只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL),15只腦脊液中出現(xiàn)ATCC 29544株。而益生菌預(yù)防組20只乳鼠中,LGG組有12只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL), SK08組有11只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL),混合益生菌組有11只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL),三組腦脊液中均沒有出現(xiàn)菌ATCC 29544株；益生菌治療組20只乳鼠中,LGG組有14只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL), SK08組和混合益生菌組有12只出現(xiàn)菌血癥(105cfu/mL), SK08組和混合益生菌組腦脊液中均沒有出現(xiàn)ATCC 29544株,而LGG組腦脊液中有1只出現(xiàn)ATCC 29544株。結(jié)果表明：脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG可以抑制致病菌穿透腸屏障,從而減少了進入血腦屏障的細菌數(shù)量,用脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG預(yù)防和治療小鼠腦膜炎具有一定效果。四、結(jié)論1、脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG能黏附于腸上皮細胞,并能顯著抑制阪崎克羅諾桿菌對腸上皮細胞的黏附、侵襲；2、脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG可上調(diào)腸上皮細胞粘蛋白MUC-2基因表達,保護腸上皮細胞免受致病菌的損傷,這可能成為拮抗致病菌黏附、侵襲的保護機制之一；3、新生乳鼠體內(nèi)實驗顯示,脆弱擬桿菌BF SK08和益生菌LGG可以預(yù)防和治療阪崎克羅諾桿菌引起的腦膜炎；4、結(jié)合體內(nèi)外實驗結(jié)果,脆弱擬桿菌SK08和益生菌LGG對阪崎克羅諾桿菌引起的腦膜炎預(yù)防效果優(yōu)于治療效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R515.2

【共引文獻】

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本文編號：1402803