發(fā)布時間：2018-01-08 21:28

  本文關(guān)鍵詞：白三烯B4在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫中的作用及機制研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：結(jié)核病(TB)仍然是全球范圍公共健康問題,主要由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)感染引起,Mtb是一種胞內(nèi)寄生菌,感染人體后主要居住在巨噬細(xì)胞內(nèi),巨噬細(xì)胞作為吞噬Mtb的主要細(xì)胞在感染Mtb的機體固有免疫應(yīng)答中起主要作用,構(gòu)成機體防御的第一道防線,該細(xì)胞主要通過吞噬、生成自由基及多種細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、抗原提呈等多種途徑殺滅Mtb。宿主抗Mtb感染的免疫機制復(fù)雜,眾多免疫相關(guān)的介質(zhì)參與其中,巨噬細(xì)胞是白三烯B4(LTB4)的主要來源之一,白三烯是花生四烯酸通過5-脂氧合酶途徑代謝的產(chǎn)物,是有效的促炎脂質(zhì)介質(zhì),研究表明LTB4具有多重功能,可導(dǎo)致白細(xì)胞趨化、粘附、脫顆粒、細(xì)胞因子分泌,可以影響多種生物效應(yīng),參與許多免疫性疾病的病理過程,如哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等,在疾病的病理過程中發(fā)揮重要作用。近年來LTB4在感染性疾病發(fā)揮的作用日益受到重視,包括寄生蟲、細(xì)菌感染,但目前有關(guān)LTB4在結(jié)核感染中發(fā)揮的作用少有報道。本研究提出旨在探索如下問題:結(jié)核感染是否促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)LTB4,白三烯B4對巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫中發(fā)揮的作用以及可能的機制,期望為臨床抗結(jié)核病的輔助治療提供實驗依據(jù)。實驗一:結(jié)核分枝桿菌及其抗原成份對巨噬細(xì)胞LTB4表達(dá)的影響目的:了解結(jié)核感染中引起巨噬細(xì)胞表達(dá)LTB4的成分。方法:采用不同劑量結(jié)核重組抗原Ag85B、ESAT-6和菌株H37Ra及BCG與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)4、24h,留取培養(yǎng)上清,ELISA檢測LTB4表達(dá)量。結(jié)果:在共培養(yǎng)4h、24h時間段,巨噬細(xì)胞在結(jié)核及其抗原的刺激下均能生成LTB4,除H37Ra組外實驗組與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異,且LTB4的量分別隨Ag85B,ESAT-6量增多而增多,培養(yǎng)24h各組生成的白三烯B4量少于4h。結(jié)論:BCG和結(jié)核分支桿菌分泌蛋白ESAT-6、Ag85B促進(jìn)巨噬細(xì)胞早期表達(dá)LTB4,而熱滅活H37Ra不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)LTB4。實驗二:LTB4對巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫的作用目的:探索LTB4在巨噬細(xì)胞感染Mtb過程中發(fā)揮的作用。方法:采用改良抗酸染色方法確定THP-1吞噬現(xiàn)象,通過流式細(xì)胞術(shù)定量檢測吞噬率;流式檢測LTB4對感染細(xì)胞活性氧的影響;酸性磷酸酶染色確定LTB4對溶酶體影響;流式檢測感染細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:(1)比較加入LTB4后THP-1細(xì)胞對BCG的吞噬變化,在培養(yǎng)4h不同濃度外源性LTB4(1-100nM)都可以促進(jìn)吞噬,吞噬率隨劑量升高而升高,且這種作用可以被LTB4的BLT1受體阻滯劑U75302抑制,培養(yǎng)24h無促吞噬作用。(3)LTB4可以促進(jìn)細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生,并且可以提高感染細(xì)胞的活性氧。(4)LTB4促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡。結(jié)論:白三烯B4可以促進(jìn)THP-1細(xì)胞吞噬Mtb,并通過產(chǎn)生活性氧和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫作用。實驗三:探索LTB4對巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫作用的機制目的:探索LTB4影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫可能的機制。方法:巨噬細(xì)胞和結(jié)核共培養(yǎng)4、24h,施加不同的干預(yù)措施,采用qPCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗測定感染結(jié)核的巨噬細(xì)胞TNF-α的mRNA及培養(yǎng)上清蛋白水平的表達(dá),以及LTB4生成關(guān)鍵酶LTA4H的mRNA及LTB4表達(dá)水平。結(jié)果:感染4h、24h,外源性LTB4對感染結(jié)核巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平均無影響,但促進(jìn)其mRNA表達(dá),4h后LTA4H生成抑制劑Bestatin下調(diào)TNF-α的mRNA水平,24h后LTB4受體抑制劑U75302下調(diào)TNF-α的mRNA水平。結(jié)論:外源性LTB4不影響TNF-α表達(dá),但增高其mRNA水平,應(yīng)用LTB4抑制劑可部分下調(diào)TNF-α的mRNA表達(dá)水平。
[Abstract]:Tuberculosis (TB) is still a global public health problem, mainly by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection, Mtb is an intracellular pathogen infection in the human body, mainly living in macrophages and macrophage phagocytosis of Mtb cells as the main body of the Mtb infection in the solid have played a major role in immune response, constitute the first line of defense for the body of the cell, mainly through phagocytosis, generation of free radicals and cytokines, apoptosis, immune mechanism of antigen presenting a variety of ways such as killing Mtb. host anti Mtb infection complicated, many immune related mediators involved, macrophage leukotriene B4 (LTB4) is one of the main sources, is a product of leukotrienes four arachidonic acid by 5- lipoxygenase pathway, proinflammatory lipid mediators is effective, the results show that LTB4 has multiple functions, can lead to leukocyte chemotaxis, adhesion, degranulation, cytokine Secretion, can affect a variety of biological effects, pathological processes involved in many autoimmune diseases such as asthma, rheumatoid arthritis, play an important role in the pathological process of the disease. In recent years LTB4 in infectious diseases play increasingly important role, including parasites, bacterial infection, but the LTB4 in tuberculosis the role is rarely reported. This study aims to explore the following questions: whether tuberculosis infection promotes macrophage LTB4 expression play leukotriene B4 on macrophages anti TB immune function and the possible mechanism, to provide experimental basis for clinical adjuvant therapy of anti tuberculosis expectations. Experiment one: effects of Mycobacterium tuberculosis and its antigens expressed on macrophages Objective: To investigate the LTB4 tuberculosis infection caused by macrophages expressing LTB4 components. Methods: using different doses of tuberculosis recombinant antigen Ag85B, ESAT 4,24h and -6 co cultured strains H37Ra and BCG with macrophages, collected supernatant, detect the expression of ELISA LTB4. Results: in co culture 4h, 24h period, LTB4 in macrophages can produce tuberculosis and antigen stimulation, except group H37Ra experimental group compared with the control group had statistically significant difference, and the amount of LTB4 respectively with Ag85B, ESAT-6 increased and increased the amount of 24h training of leukotriene B4 generation were less than 4h. conclusion: the secreted protein ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis BCG and Ag85B, promote the expression of LTB4 of macrophages, and heat inactivated H37Ra can promote the expression of LTB4. in experiment two macrophages: effect of LTB4 on macrophages anti tuberculosis immunity objective: To explore the role LTB4 play in the infection of macrophages in the process of Mtb. Methods: using the modified acid fast staining method to determine THP-1 phagocytosis, by flow cytometry quantitative detection of phagocytic rate; flow cytometry detection of LTB4 infection on fine Influence of intracellular reactive oxygen species; acid phosphatase staining to determine the effect of LTB4 on lysosomes; flow cytometry infected cells apoptosis rate. Results: (1) comparison with changes in phagocytosis of THP-1 cells to BCG LTB4 after 4H in culture, different concentrations of exogenous LTB4 (1-100nM) can promote the phagocytosis, phagocytosis rate with the dose increased. And this effect can be BLT1 receptor antagonist U75302 LTB4 inhibition, 24h culture without promoting phagocytosis. (3) LTB4 cells can promote the generation of reactive oxygen species and oxygen can increase the activity of infected cells. (4) LTB4 infection promote cell apoptosis. Conclusion: leukotriene B4 can promote THP-1 cell phagocytosis of Mtb, and the the production of reactive oxygen species and promoting apoptosis effect of macrophages anti tuberculosis immunity. Experiment three: Objective To explore the mechanism of LTB4 on macrophage anti tuberculosis immune function: To explore the mechanism of LTB4 on macrophages anti tuberculosis immunity may be. Methods: 4,24h were co cultured with macrophages and tuberculosis, applying different interventions, the supernatant protein level determination of tuberculosis infection of macrophages TNF- alpha by qPCR and enzyme-linked immunosorbent assay mRNA and culture, and the expression of mRNA and LTB4 LTA4H key enzyme generated LTB4 level. Results: 4H infection, 24h, exogenous LTB4 influence on the level of tuberculosis infection of macrophage TNF- expression, but the level of mRNA expression, 4h LTA4H inhibitor Bestatin reduced TNF- alpha mRNA levels, 24h LTB4 receptor inhibitor U75302 down-regulation of TNF- alpha mRNA levels. Conclusion: the exogenous LTB4 does not affect TNF- expression, but increased the level of mRNA, application of LTB4 inhibitor can be part of the down-regulation of TNF- expression level of mRNA alpha.

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52

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