本文關(guān)鍵詞：含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因的構(gòu)建及其修飾T細(xì)胞抗結(jié)核活性研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：背景結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的傳染性疾病。全球約1/3的人口感染MTB,其中約5-10%罹患活動性結(jié)核病,每年約900萬例新增活動性肺結(jié)核報告。近年來,由于耐多藥(MDR)和廣泛耐藥(XDR)菌株的流行、人類免疫缺陷病毒(HIV)與MTB伴發(fā)感染,使結(jié)核病成為死亡人數(shù)最高的傳染病。傳統(tǒng)結(jié)核病的治療仍以基于抗生素的化療為主,但由于療程長、副作用大、以及耐藥性等問題,導(dǎo)致結(jié)核病患者久治不愈、治療效果欠佳。MTB屬于胞內(nèi)寄生菌,體液免疫難以對其發(fā)揮作用,抗結(jié)核感染的免疫機制主要是細(xì)胞免疫,作用最關(guān)鍵的是特異性CD4+Th和CD8+CTL。T細(xì)胞過繼免疫治療可以作為對結(jié)核免疫缺陷患者和耐藥患者有效的治療方法。T細(xì)胞過繼免疫治療是體外培養(yǎng)、擴增、并利用抗原特異T細(xì)胞表面受體(TCR)基因修飾T細(xì)胞,賦予T細(xì)胞抗原識別特異性,回輸體內(nèi)從而使機體獲得大量效應(yīng)T細(xì)胞,以發(fā)揮清除MTB作用。本研究所已證實MTB抗原特異TCR基因修飾的CD4+、CD8+T細(xì)胞在具有良好的抗結(jié)核活性。然而,自體T細(xì)胞過繼免疫治療適用范圍窄,需針對病例個體進(jìn)行結(jié)核特異性抗原刺激T細(xì)胞、篩選抗原特異T細(xì)胞,建立并篩選T細(xì)胞克隆、抗原特異性TCR構(gòu)建、基因修飾T細(xì)胞等過程,其篩選的TCR基因不具有廣泛適用性,僅針對個體適用,且周期長。有研究表明流感病毒、人類皰疹病毒(EBV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)等病毒感染的病例間可觀察到TCR的偏好取用,即限制性取用特定α鏈可變區(qū)基因(Vα)、p鏈可變區(qū)基因(Vβ)或互補決定區(qū)3(CDR3)區(qū)序列,具有保守的TCR基因。這些保守TCR基因具有高活性及敏感性,對抑制病毒復(fù)制起到重要作用。在本研究中,通過CDR3譜型分析,找到86例結(jié)核初治患者中保守的CDR3序列,從GeneBank中獲取高頻使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次構(gòu)建含CDR3保守序列的TCR,對其進(jìn)行構(gòu)象預(yù)測,進(jìn)而構(gòu)建了其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,轉(zhuǎn)染2例結(jié)核患者CD4+和CD8+T細(xì)胞,分別與負(fù)載滅活H37Rv菌株的DC共培養(yǎng),檢測TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞的增殖與IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌水平,TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞IFN-γ、 TNF-α、GrB分泌水平,及其對靶細(xì)胞的殺傷作用,證實含結(jié)核特異CDR3保守序列的TCR基因修飾的T細(xì)胞具有一定的抗結(jié)核活性。目的找到結(jié)核特異CDR3保守序列,構(gòu)建含保守序列的TCR,研究其修飾患者T細(xì)胞的體外抗結(jié)核活性,為下一步動物實驗奠定基礎(chǔ),為含結(jié)核特異CDR3保守序列的TCR基因修飾T細(xì)胞應(yīng)用于結(jié)核患者群體化過繼免疫治療提供依據(jù)。方法1.通過CDR3譜型分析找到結(jié)核特異CDR3保守序列①采用淋巴細(xì)胞分離液分離結(jié)核患者和健康志愿者外周血單個核細(xì)胞(PBMC);②分別磁珠分選出CD4+、CD8+T細(xì)胞,提取CD4+和CD8+T細(xì)胞mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；③CDR3譜型分析檢測CDR3譜型,并選擇在CD4+、CD8+T細(xì)胞中,呈單克隆擴增的抗原特異TCR α、β基因家族測序分析,分析病例間結(jié)核特異CDR3保守序列及優(yōu)勢表達(dá)的V基因家族、J基因片段；④利用CDR3譜型復(fù)雜性評分系統(tǒng)對結(jié)核患者和健康志愿者進(jìn)行評分,并比較差異；⑤利用相對復(fù)雜性評分系統(tǒng)分析結(jié)核患者間CDR3區(qū)基因多樣性差異。2.構(gòu)建含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體①獲取高頻使用V基因片段,以及C基因片段的序列,構(gòu)建含CDR3保守序列的TCR,對其進(jìn)行構(gòu)象預(yù)測,分析TCR a鏈和β鏈排列組合而成的異二聚體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,確定需構(gòu)建的TCR基因：②根據(jù)人α鏈和β鏈基因家族可變區(qū)(variable region, V)和恒定區(qū)(constant region, C)基因序列設(shè)計引物,擴增含結(jié)核特異CDR3保守序列的TCR的α鏈和p鏈全長基因；③采用本實驗室已經(jīng)構(gòu)建好的最小突變C區(qū)(其中C區(qū)9個氨基酸位點替換)替換α鏈和β鏈全長基因的C區(qū)：④利用重組PCR技術(shù),將已最小突變TCRα鏈和β鏈基因通過自剪切多肽2A連接,并克隆至pGEM-T載體測序鑒定；⑤將測序正確的TCR全長基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pMX-IRES-GFP,酶切鑒定；⑥采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法,包裝逆轉(zhuǎn)錄病毒,超速離心法濃縮病毒；⑦重組病毒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)測定感染性滴度,計算公式：病毒感染滴度(IU/ml)=NIH3T3細(xì)胞總數(shù)×GFP陽性率/病毒濃縮液量(ml)。3.含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾T細(xì)胞的抗結(jié)核活性IL-2和抗CD3單抗活化T細(xì)胞后,以MOI=10將重組病毒pMX-β-2A-α-IRES-GFP轉(zhuǎn)染T細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP陽性細(xì)胞百分比。按一定效靶比(effector:target, E:T),將TCR基因修飾T細(xì)胞與負(fù)載滅活H37Rv菌株的DC混合培養(yǎng),以未轉(zhuǎn)染和空載體轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞為陰性對照,以雞卵白蛋白(ovalbumin, OVA)為非特異性抗原對照；酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)檢測一定時間TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNγ、TNF-α、IL-4分泌水平,利用WST-8法檢測TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞的增殖：ELISA檢測一定時間TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFNγ、TNF-α、GrB分泌水平,利用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)技術(shù),檢測TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞對負(fù)載MTB的DC的殺傷活性。4.統(tǒng)計學(xué)分析利用配對T檢驗方法比較健康志愿者與結(jié)核患者CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群的CDR3譜型復(fù)雜性評分：利用單因素方差分析比較3組結(jié)核患者病例組組間相對復(fù)雜性評分；利用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗評估患者年齡、型別、卡介苗接種史、結(jié)核菌素皮膚試驗、結(jié)核病史或接觸史、吸煙狀況、結(jié)核病種類間差異；利用斯皮爾曼相關(guān)性分析檢測相對復(fù)雜性評分和疾病嚴(yán)重程度以及其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性。CD4+T、CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌水平的差異、CD8+T殺傷率應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA),方差不齊時用Welch校正,各組間兩兩比較方差齊時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett's T3法,采用析因設(shè)計資料的方差分析CD4+T細(xì)胞增殖水平。檢驗水準(zhǔn)a=0.05,雙側(cè)檢驗。采用SPSS 13.0 for windows統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果1.通過CDR3譜型分析找到結(jié)核特異CDR3保守序列檢測86例結(jié)核患者CDR3譜型,對單克隆增生T細(xì)胞進(jìn)行TCR基因測序,結(jié)果顯示：86例病例中V基因片段高頻使用Va7 (43.02%). Va9 (48.84%)、Vα17 (50%)、Vα32(41.86%)、Vβ19(86.5%)、Vβ24 (62.79%)基因家族。分析其CDR3區(qū)基因序列,結(jié)果顯示：J基因片段中Jα34, Jα57, Jβ2-1出現(xiàn)頻率較高；Vα鏈和Vβ鏈CDR3區(qū)存在保守序列,其中TCR　Vα鏈CDR3區(qū)中存在GGGGNKLI. GGGNEQYF. APDTGSGAF保守序列,TCR　Vβ鏈中存在GGGNKLI、TNKUI、 SADKLI保守序列。2.構(gòu)建含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體從GeneBank中獲取高頻使用V、J基因片段、以及C基因片段的序列,將CDR3保守序列與V、J、C基因片段拼接成全長α、β鏈基因序列,并對α、β鏈隨機搭配組合形成的TCR進(jìn)行構(gòu)象預(yù)測,選出穩(wěn)定性較佳的TCR Vβ19. Va7雙鏈。成功擴增出經(jīng)最小突變的含有結(jié)核特異CDR3保守序列的TCRβ及a鏈全長基因,經(jīng)TA克隆后測序,Vβ19、Va7基因序列與預(yù)期的V區(qū)序列完全一致,C區(qū)的基因序列與預(yù)期相符。利用自剪切多肽2A,通過重組PCR,擴增出T細(xì)胞的hVp 19mCβ-2 A-hVa7mC融合基因,將其插入pMX-IRES-GFP,構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMX-hVp19mCβ-2A-hVa7mCa-IRES-GFP,酶切鑒定證實基因片段插入正確。將其與包膜蛋白質(zhì)粒VSV-G共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞GP2-29 3,48h后取病毒上清,濃縮純化后感染NIH3T3細(xì)胞,檢測病毒感染滴度。3.檢測含CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞的抗結(jié)核活性①檢測TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α、IL-4分泌按E：T=7,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)18h,ELISA檢測上清中IFN-y的分泌水平。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組IFN-y分泌水平顯著高于UnTd+DC組(P0.001),略高于另外三組但差異不顯著；患者2的Td+MTB組IFN-y分泌水平顯著高于其他各組(P0.05)。按E：T=20,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h,ELISA檢測上清中TNF-α的分泌水平。結(jié)果顯示,2例患者Td+MTB組的TNF-a分泌水平均顯著高于其他各組(P0.001)。按E：T=15,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h, ELISA檢測上清中IL-4的分泌水平。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組IL-4分泌水平顯著低于UnTd+DC組、EmTd+MTB組和Td+OVA組(P0.001),略低于UnTd+MTB組但差異不顯著；患者2的Td+MTB組IL-4分泌水平顯著低于其他各組(P0.05)。②檢測TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞的增殖按E：T=7,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD4+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng),測定第7天各組CD4+T細(xì)胞的增殖水平。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組增殖水平顯著高于UnTd+DC組和UnTd+MTB組(P0.05),略高于其它兩組但差異不顯著；患者2各組間增殖水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),但Td+MTB組T細(xì)胞增殖水平略高于其它各組。4.檢測含CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞的抗結(jié)核活性①檢測TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α、GrB分泌按E：T=7,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)18h, ELISA檢測上清中IFN-y的分泌水平。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組IFN-γ分泌水平顯著高于Td+OVA組(P0.05),略高于其它三組但差異不顯著；患者2的Td+MTB組IFN-γ分泌水平顯著高于其他各組(P0.05)。按E：T=20,將含保守CDR3序列TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h,ELISA檢測上清中TNF-α的分泌水平。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組TNF-α分泌水平顯著高于UnTd+DC組、UnTd+MTB組和Td+OVA組(P0.05),略高于EmTd+MTB組但差異不顯著；患者2的Td+MTB組TNF-α分泌水平顯著高于其他各組(P0.05)。按E：T=20,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng)24h,ELISA檢測上清中GrB的分泌水平。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組GrB分泌水平顯著高于其他各組(P0.001);患者2的Td+MTB組GrB分泌水平顯著高于UnTd+DC組、UnTd+MTB組和Td+OVA組(P0.05),略高于EmTd+MTB組但差異不顯著。②檢測TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞的殺傷活性按E：T=30,將含結(jié)核特異CDR3保守序列TCR基因修飾CD8+T細(xì)胞和負(fù)載滅活MTB的DC混合培養(yǎng),檢測各組CD8+T細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果顯示,患者1的Td+MTB組的殺傷率顯著高于UnTd+DC組、UnTd+MTB組和EmTd+MTB組(P0.05),略高于Td+OVA組但差異不顯著；患者2的Td+MTB組的殺傷率顯著高于其他各組(P0.05)。結(jié)論在本研究中,通過CDR3譜型分析,找到86例結(jié)核初治患者中保守的CDR3序列,從GeneBank中獲取高頻使用V基因、J基因片段,以及C基因片段的序列,首次構(gòu)建含CDR3保守序列的TCR,對其進(jìn)行構(gòu)象預(yù)測,進(jìn)而構(gòu)建了其重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒,轉(zhuǎn)染2例結(jié)核患者CD4+和CD8+T細(xì)胞,證實其具有一定的體外抗結(jié)核活性,為含結(jié)核特異CDR3保守序列的TCR基因修飾T細(xì)胞應(yīng)用于結(jié)核患者群體化過繼免疫治療奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52

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7 商亞;PRDM1-ATG5與中國漢族人群結(jié)核發(fā)生風(fēng)險性的關(guān)聯(lián)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2014年

8 李欣欣;某胸科醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員潛伏結(jié)核感染篩查及相關(guān)危險因素研究[D];山東大學(xué);2012年

9 馬慧;上海地區(qū)結(jié)核病患者接觸者感染率和結(jié)核易感性研究[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

10 丁皓;新型抗結(jié)核先導(dǎo)化合物及其藥靶的研究與發(fā)現(xiàn)[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

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本文編號：1359467