本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子PU.1在煙曲霉感染中的天然免疫作用和機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： PU.1 Dectin-1 TLR-2 TLR-4 煙曲霉 天然免疫

【摘要】：研究背景煙曲霉(Aspergillus fumigatus, A. fumigatus)是一種常見的腐生型真菌,通常以孢子的形式廣泛存在于我們周圍環(huán)境中,正常人體每天都會(huì)吸入少量的孢子。對于免疫功能正常的人群來說,吸入的煙曲霉孢子能夠及時(shí)被肺部免疫系統(tǒng)有效識別并清除,從而避免了疾病的發(fā)生。但是,對于免疫抑制的人群來說,吸入煙曲霉孢子則可能會(huì)導(dǎo)致多種類型的感染性疾病,如侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、曲霉球(aspergilloma)和變應(yīng)性支氣管肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA)等。其中,IPA是一種致命性的煙曲霉感染,主要發(fā)生于艾滋病、腫瘤化療、糖皮質(zhì)激素治療、造血干細(xì)胞移植或?qū)嶓w器官移植等免疫抑制的人群。近年來,隨著免疫抑制人群數(shù)量的增加,IPA的發(fā)病率和死亡率逐年升高。并且,盡管真菌感染的診斷技術(shù)和治療手段發(fā)展迅速,IPA患者的病死率仍然很高,預(yù)后仍然很差。因此,更好的了解宿主對抗煙曲霉感染的免疫防御機(jī)制,能夠?yàn)镮PA的防治提供新的思路和手段。天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗入侵病原體的第一道防線,肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages, AMs)是肺部最重要的天然免疫細(xì)胞,它能夠通過其表面的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)特異性的識別真菌細(xì)胞壁的病原體分子相關(guān)模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),啟動(dòng)天然免疫反應(yīng)。其中,樹突狀細(xì)胞相關(guān)C型凝集素受體-1(dendritic cell-associated C-type lectin receptor, Dectin-1)、Toll樣受體-2(toll-like receptor, TLR-2)和TLR-4是研究最多的參與煙曲霉感染的PRRs,它們能夠識別煙曲霉細(xì)胞壁的不同成分,介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬和殺滅入侵的煙曲霉孢子,釋放促炎因子和趨化因子等,并進(jìn)一步激活宿主的適應(yīng)性免疫反應(yīng),增強(qiáng)宿主對入侵煙曲霉的殺滅和清除能力。研究證實(shí),無論在人類還是小鼠,Dectin-1、TLR-2和TLR-4基因沉默或敲除后,宿主對煙曲霉的易感性明顯升高,并且具有較低的炎癥因子水平和較高的組織真菌負(fù)荷,而基因敲除的小鼠死亡率也明顯升高。因此,Dectin-1、TLR-2和TLR-4在抗煙曲霉天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子PU.1是ETS(E26-transformation-specific)家族的重要成員之一,對于人類,它主要由脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene-1,SPI1)基因編碼。研究發(fā)現(xiàn),PU.1的主要功能是參與造血系統(tǒng)的分化和發(fā)育。但越來越多的研究證實(shí),PU.1能夠參與宿主天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在成熟的巨噬細(xì)胞中,PU.1能夠結(jié)合某些重要基因的啟動(dòng)子區(qū)域,在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控它們的表達(dá),包括Dectin-1、TLR-2和TLR-4,但是在翻譯水平和他們的功能方面研究較少。因此,鑒于Dectin-1、TLR-2和TLR-4在煙曲霉感染中的重要作用和PU.1對它們的調(diào)控作用,我們設(shè)想,高表達(dá)或沉默PU.1能夠影響宿主細(xì)胞抗煙曲霉感染的天然免疫作用。本研究使用人急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞株(human acute monocytic leukemia cell line, THP-1)經(jīng)佛波酯(phorbolmyristate acetate, PMA)誘導(dǎo)貼壁,獲得了體外AMs細(xì)胞模型THP-1巨噬細(xì)胞。并通過PU.1基因重組腺病毒(recombinant adenovirus, Ad-PU.1)和PU.1小干擾RNA(small interfering RNA, PU.1 siRNA)成功構(gòu)建了PU.1高表達(dá)和沉默的THP-1巨噬細(xì)胞模型,并進(jìn)一步驗(yàn)證了干預(yù)PU.1后,THP-1巨噬細(xì)胞抵抗煙曲霉感染的天然免疫功能的變化。第一章構(gòu)建并鑒定PU.1高表達(dá)或沉默的THP-1巨噬細(xì)胞模型目的分別使用Ad-PU.1和PU.1 siRNA體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,并進(jìn)一步研究PU.1干預(yù)后Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表達(dá)變化。方法①使用攜帶綠色熒光蛋白基因的空病毒載體(adenovirus vector containing enhanced green fluorescent protein gene, Ad-EGFP)分別以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)等于500,1000,1500和2000轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后的綠色熒光蛋白表達(dá)情況,來確定腺病毒載體的最佳MOI值;②使用Ad-PU.1以最佳MOI值轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(Ad-PU.1組),設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染空病毒(adenovirus vectors,Ad)細(xì)胞組(Ad組)作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,通過Real-time PCR、Western blot方法分別在基因mRNA和蛋白水平檢測PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表達(dá)變化；③使用PU.1 siRNA體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(siPU.1組),分別設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染陰性對照小干擾RNA(small negative control siRNA, PU.l siNC)的細(xì)胞組(siNC組)作為對照組。48 h后分別提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,通過Real-time PCR、Western blot方法分別在基因mRNA和蛋白水平檢測PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表達(dá)變化。結(jié)果①使用Ad-EGFP以MOI=1500轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞48 h后,綠色熒光最強(qiáng),且在轉(zhuǎn)染72 h后,仍可觀察到較強(qiáng)的綠色熒光；②使用Ad-PU.1(MOI=1500)轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞48 h后,Ad-PU.1組的PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4mRNA分別較Mock組升高了80.39倍(p0.001)、8.31倍(p0.01)、2.56倍(p0.001)和4.28倍(p0.05),較Ad組分別升高了51.6倍(p0.001)、3.05倍(p0.05)、2.26倍(p0.001)和2.92倍(p0.05),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③使用PU.1 siRNA轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞48 h后,siPU.1組的PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4 mRNA表達(dá)量分別為Mock組的19.0%(p0.001)、53.7%(p0.01)、59.7%(p0.01)和56.6%(p0.05)、是siNC組的17.7%(p0.001)、47.1%(p0.01)、64.4%(p0.05)和61.2%(p0.05),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外,PU.1、Dectin-1、TLR-2和TLR-4在蛋白水平上均有不同程度的變化,且與它們對應(yīng)的基因mRNA表達(dá)變化趨勢相同。結(jié)論P(yáng)U.1高表達(dá)和沉默的THP-1巨噬細(xì)胞模型構(gòu)建成功。高表達(dá)PU.1能夠引起Dectin-1、TLR-2和TLR-4的表達(dá)升高,而沉默PU.1能夠降低三者的表達(dá)。第二章PU.1高表達(dá)的THP-1巨噬細(xì)胞在煙曲霉感染中的作用目的通過Ad-PU.1體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,探討高表達(dá)PU.1對THP-1巨噬細(xì)胞抗煙曲霉感染能力的影響。方法①使用Ad-PU.1體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(Ad-PU.1組),分別設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染Ad的細(xì)胞組(Ad組)作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后,用靜息期的煙曲霉孢子刺激Oh、4h、8h和12 h,分別提取對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA,并收集各個(gè)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清。Real-time PCR法檢測0 h、4 h、8 h和12 h的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-10mRNA的表達(dá),ELISA法檢測4 h、8 h和12 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a和IL-10的含量；②使用Ad-PU.1體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(Ad-PU.1組),設(shè)置未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染Ad的細(xì)胞組(Ad組)作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后,使用綠色熒光染料(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的靜息期煙曲霉孢子刺激4 h后,分別對細(xì)胞膜和細(xì)胞核進(jìn)行染色處理,通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對煙曲霉孢子的吞噬能力；③使用Ad-PU.1體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(Ad-PU.1組),設(shè)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染Ad的細(xì)胞組(Ad組)作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后,用靜息期煙曲霉孢子分別刺激0 h、4 h和8 h,通過平板菌落試驗(yàn)觀察THP-1巨噬細(xì)胞對煙曲霉孢子的殺滅能力。結(jié)果①在煙曲霉孢子刺激48 h后,Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)Ad-PU.1組中的TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量較對照組(Mock組和Ad組)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但I(xiàn)L-10 mRNA的表達(dá)較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)過煙曲霉孢子刺激后,Ad-PU.1組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-1β濃度較對照組明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而IL-10的水平與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②激光共聚焦顯微鏡結(jié)果證實(shí),與對照組相比,PU.1高表達(dá)的THP-1巨噬細(xì)胞對FITC標(biāo)記的煙曲霉孢子的吞噬能力明顯增強(qiáng)；③平板菌落試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí),高表達(dá)PU.1能夠增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞對煙曲霉孢子的殺滅能力。結(jié)論在煙曲霉感染過程中,PU.1高表達(dá)的THP-1巨噬細(xì)胞能夠釋放更多的炎癥因子TNF-a和IL-1p,而抗炎因子IL-10表達(dá)無明顯變化。并且,高表達(dá)PU.1能夠增強(qiáng)THP-1巨噬細(xì)胞對煙曲霉孢子的吞噬和殺滅能力。第三章PU.1沉默的THP-1巨噬細(xì)胞在煙曲霉感染中的作用目的通過PU.1 siRNA體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞,探討沉默PU.1對THP-1巨噬細(xì)胞抗煙曲霉感染能力的影響。方法①使用PU.1 siRNA體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(siPU.1組),同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染陰性小干擾RNA(negative control siRNA, siNC)的細(xì)胞組(siNC組)作為對照組。轉(zhuǎn)染48 h后,分別用靜息期煙曲霉孢子刺激0 h、4 h、8 h和12 h,分別提取對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA,并收集各個(gè)對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)上清。Real-time PCR法檢測0 h、4 h、8 h和12 h的炎癥因子TNF-α、IL-1p和IL-10 mRNA的表達(dá)變化,并使用ELISA法分別檢測4 h、8 h和12 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-a和IL-10的含量；② PU.1 siRNA體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(siPU.1組),同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞組(siNC組)作為對照組。使用FITC標(biāo)記的靜息期煙曲霉孢子刺激4 h后,分別使用細(xì)胞膜染料Dil和細(xì)胞核染料DAPI對細(xì)胞進(jìn)行染色處理,激光共聚焦顯微鏡觀察THP-1巨噬細(xì)胞對煙曲霉孢子的吞噬情況；③ PU.1 siRNA體外轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞(siPU.1組),同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組(Mock組)和轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞組(siNC組)作為對照組。用靜息期的煙曲霉孢子刺激0 h、4 h和8 h后,通過平板菌落試驗(yàn)觀察細(xì)胞對煙曲霉孢子的殺滅能力。結(jié)果① Real-time PCR法檢測發(fā)現(xiàn),在煙曲霉孢子刺激后,siPU.1組的TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)水平較對照組(Mock組和siNC組)顯著降低,而IL-10mRNA的表達(dá)量較對照組升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;ELISA法檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)過煙曲霉孢子刺激后,siPU.1組的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α水平較對照組降低,但I(xiàn)L-10的表達(dá)明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；②沉默PU.1后,激光共聚焦顯微鏡觀察到THP-1巨噬細(xì)胞對FITC標(biāo)記的煙曲霉孢子的吞噬能力較對照組明顯增強(qiáng)。③平板菌落試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí),沉默PU.1能夠降低THP-1巨噬細(xì)胞對煙曲霉孢子的殺滅能力。結(jié)論在煙曲霉感染過程中,沉默PU.1能夠?qū)е卵装Y因子TNF-α和IL-1p的釋放顯著減少,而IL-10表達(dá)升高。并且,PU.1沉默的THP-1巨噬細(xì)胞對煙曲霉孢子的吞噬和殺滅能力明顯減弱。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R519

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本文編號：1267704