本文關(guān)鍵詞：miRNA-20a靶向ATG16L1和ATG7抑制細(xì)胞自噬介導(dǎo)BCG的存活

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【摘要】：目的研究miR-20a對(duì)自噬基因ATG16L1和ATG7的靶向調(diào)控作用,及其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活的影響。方法1.利用雷帕霉素、3-MA和BCG處理RAW264.7細(xì)胞后,采用qRT-PCR檢測(cè)miR-17-92簇中miR-20a等6種miRNAs的表達(dá)量;通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析miR-20a對(duì)自噬基因ATG16L1和ATG7靶向調(diào)控作用。2.分別將ATG16L1 3’UTR和ATG7 3’UTR及其突變體克隆到pMIR-Report質(zhì)粒中,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western blot,驗(yàn)證miR-20a對(duì)ATG16L1和ATG7的靶向調(diào)控作用。3.將miR-20a mimic和mi R-20a inhibitor分別轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中,同時(shí)利用雷帕霉素與BCG刺激后,通過(guò)激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、Western blot方法分別檢測(cè)自噬小體分布及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平,研究miR-20a對(duì)自噬過(guò)程的調(diào)控作用。4.將miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分別轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中,同時(shí)用BCG和雷帕霉素處理細(xì)胞,利用qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中BCG的存活量。研究miR-20a對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)BCG存活量的調(diào)控作用。結(jié)果1.與對(duì)照組相比,雷帕霉素組RAW264.7細(xì)胞的miR-17、miR-18a、mi R-20a表達(dá)水平顯著上調(diào)(P0.05);3-MA組RAW264.7細(xì)胞的miR-20a表達(dá)水平顯著下調(diào)(P0.05)。與對(duì)照組相比,BCG感染細(xì)胞6h時(shí),miR-20a的表達(dá)水平升高約8倍(P0.01)。感染時(shí)間的延長(zhǎng)至48h時(shí),miR-20a的表達(dá)水平較之前有所下降,但仍高于對(duì)照組(P0.05)。2.生物信息學(xué)分析表明,ATG16L1和ATG7是miR-20a的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-20a mimic可明顯抑制ATG16L1的相對(duì)熒光素酶活性,其活性下降約1.8倍(P0.05);而轉(zhuǎn)染ATG16L1-mut組相對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有明顯變化。轉(zhuǎn)染miR-20a mimic組ATG7的相對(duì)熒光素酶活性受到明顯抑制,下降約1.6倍(P0.05);而ATG7-mut組相對(duì)熒光素酶活性沒(méi)有明顯變化。結(jié)果表明,miR-20a可與ATG16L1 3′-UTR和ATG7 3′-UTR特異性結(jié)合抑制其表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,mi R-20a mimic能明顯抑制ATG16L1和ATG7蛋白的表達(dá),而miR-20a inhibitor組ATG16L1和ATG7蛋白表達(dá)量明顯升高(P0.05),結(jié)果表明miR-20a可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ATG16L1和ATG7的表達(dá)。3.細(xì)胞免疫熒光和透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-20a mimic組自噬小體標(biāo)志蛋白LC3均勻分布于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中,自噬小體數(shù)量明顯減少;相反,miR-20a inhibitor組細(xì)胞內(nèi)的點(diǎn)狀自噬小體明顯增多。Western blot檢測(cè)LC3的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-20a mimic組LC3-II表達(dá)量明顯減少,LC3II/LC3I比值降低;miR-20a inhibitor組LC3II表達(dá)量明顯升高,LC3II/LC3I比值升高;結(jié)果表明,miR-20a可以通過(guò)靶向抑制ATG16L1和ATG7的表達(dá)抑制BCG介導(dǎo)的細(xì)胞自噬過(guò)程。4.在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-20a mimic、inhibitor、靶基因siRNA,并向每組細(xì)胞中加入1×107/L的BCG共培養(yǎng)24 h。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BCG存活量,結(jié)果顯示,miR-20a mimic組的BCG存活量顯著高于正常組(P0.01),反之,轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor后BCG存活量顯著低于正常組(P0.01)。表明miR-20a可促進(jìn)BCG在巨噬細(xì)胞中的存活。結(jié)論1.miRNA-20a可靶向抑制ATG16L1和ATG7蛋白的表達(dá),抑制細(xì)胞的自噬水平,負(fù)向調(diào)控RAW264.7巨噬細(xì)胞的自噬。2.miRNA-20a通過(guò)抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞的自噬水平,上調(diào)BCG在巨噬細(xì)胞中的存活量。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R52

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