本文關(guān)鍵詞：miR-21和miR-132在HepG2.2.15細胞中對慢性HBV感染及c-myc、PTEN基因表達的作用

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【摘要】：研究背景和目的HBV感染是世界性衛(wèi)生難題,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年公布數(shù)據(jù),目前全球有2.4億慢性乙型肝炎患者,每年有超過78萬人死于由乙型肝炎所致肝硬化和肝癌等并發(fā)癥。目前HBV的治療主要依賴于干擾素和核苷酸類似物,不但未能完全清除HBV,且有一定的毒副作用及停藥易反跳、潛在耐藥性等缺點。而microRNA在感染方面的重要作用為進一步研究HBV感染提供了新的方法。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,成熟的miRNA通過形成RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC),調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達。miRNA除了參與正常的生理過程外,還在感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展、心腦血管疾病等方面發(fā)揮重要的作用,為相關(guān)疾病的診治提供新的突破點。而miR-21和miR-132是近年發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關(guān)的miRNA。miR-21參與肝臟損傷的修復過程,在急性肝衰竭、部分肝切除后miR-21表達升高,促進正常肝細胞再生,但其本質(zhì)上是一種充當促癌基因作用的miRNA,參與多種腫瘤細胞的增殖、凋亡和侵襲過程。尤為特殊的是miR-21在與HBV、EB等病毒感染相關(guān)的癌癥中起促癌作用。miR-21在HBV相關(guān)性肝癌(HCC)中表達升高,目前研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過抑制促凋亡蛋白PTEN、Fas-L等抑癌基因的表達,發(fā)揮促癌基因的作用。miR-21還可與HBx蛋白相互促進,參與HBV的感染過程。c-myc基因則是HBx發(fā)揮促癌作用的途徑之一。c-myc基因是較早發(fā)現(xiàn)的促癌基因之一,其蛋白可與DNA結(jié)合,通過多種機制促進肝癌細胞的增殖。因此我們以可試圖進一步明確miR-21在慢性HBV感染中對HBV復制、表達的影響,以及其在HBV相關(guān)性HCC中對c-myc基因表達的影響。miR-132廣泛參與多種細菌、病毒感染和腫瘤致病過程。既往在免疫細胞中的研究發(fā)現(xiàn),miR-132對病毒感染主要起促進作用。miR-132表達升高可抑制巨噬細胞中轉(zhuǎn)錄輔激活物p300 (transcriptional coactivator p300)的表達,從而降低干擾素-y (IFN-γ)的表達。但在HBV感染相關(guān)肝癌(HCC)中,miR-132的表達被HBx抑制,且miR-132表達降低與HCC的發(fā)展相關(guān),提示miR-132在HBV感染中所起的作用可能與其在免疫細胞中不同。在HCC中,有研究證實miR-132能通過Akt/mTOR信號通路(Akt/Mtor signaling pathway)和Yes-associated protein (YAP)抑制癌細胞增殖。而PTEN基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是Akt信號通路上游作用因子之一,其表達降低是HCC發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。Targetscan數(shù)據(jù)預測提示PTEN基因是miR-132的作用靶點之一。因此,進一步探討miR-132在慢性HBV感染中對HBV復制、表達及PTEN基因的表達所起的作用是本研究的另一方面。研究方法1.pmR-21和pmR-132真核重組過表達載體的構(gòu)建通過miRBase數(shù)據(jù)庫分別查找pre-miR-21(miR-21前體)和pre-miR-132(miR-132前體)序列及其上下游各100bp側(cè)翼序列,用Oligo7軟件設(shè)計引物。提取HepG2.2.15細胞的DNA作為模板,用PCR擴增前體序列。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后分別和pmR-mCherry質(zhì)粒用T4連接酶于16℃過夜連接。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α,進行卡那霉素抗性平板篩選。16小時后挑取陽性菌落進行菌落PCR和搖菌擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒進行雙酶切,以1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定重組載體正確性。最后選取電泳陽性組的菌株進行測序鑒定。2.重組載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞和HepG2細胞HepG2.2.15細胞培養(yǎng)于含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中(同時添加200 mg/L的G418、10 g/L L-谷氨酰胺以及100000 IU/L青鏈霉素),HegG2細胞培養(yǎng)于含10%FBS和100000 IU/L青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。取經(jīng)去內(nèi)毒素提取的重組載體和pmR-mCherry空質(zhì)粒按試劑盒操作進行轉(zhuǎn)染,分為pmR-21/pmR-132重組載體組、空載體組、空白組、HepG2陽性對照組。轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡下觀察載體熒光蛋白表達效果。3.流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染24h后,用胰酶消化各組細胞,PBS清洗3次,用加樣槍輕輕吹勻后上機檢測,激發(fā)波長為480nm,檢測波長為620nm,設(shè)空白組為對照孔。4.miR-21和miR-132 qPCR相對定量檢測轉(zhuǎn)染24h后,收集各組細胞,提取總RNA,以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以總RNA為模板,設(shè)計針對miR-21、miR-132成熟序列的特異性RT-PCR莖環(huán)引物(由廣州銳博生物公司設(shè)計合成),逆轉(zhuǎn)錄后進行qPCR,以U6為內(nèi)參。采用2-"俊鱟t相對定量分析方法檢測各組miR-21、miR-132的相對表達量。5.化學發(fā)光法檢測培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg取轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h各組細胞培養(yǎng)上清液(陽性對照組除外),1500rpm離心5min,吸取上清,用化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測。6.培養(yǎng)液HBV DNA拷貝數(shù)檢測收集轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h各組細胞培養(yǎng)上清液(陽性對照組除外),1500rpm離心5min,按試劑盒操作處理樣品,用定量PCR儀檢測。每管設(shè)2個復孔。7. c-myc基因mRNA水平的RT-PCR檢測以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進行PCR擴增。上游引物為CGTCCTCGGATTCTCTGCTC,下游引物為GCTGGTGCATTTTCGGTTGT。內(nèi)參為GAPDH,上游引物為：GCTCTCTGCTCCTCCTGT,下游引物為：ATGAGTCCTTCCACGATAC。PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳后進行灰度值分析。8. PTEN基因mRNA水平的RT-PCR檢測以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進行PCR擴增。PTEN上游引物為：GGGGTGGAACTGTGCACTAA,下游引物為TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG.內(nèi)參為GAPDH,引物同前述。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳和灰度值分析。9. c-myc/PTEN基因蛋白水平的western blot檢測在轉(zhuǎn)染72小時后提取各組細胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度并調(diào)節(jié)各組蛋白樣品濃度至相等,變性后進行SDS-PAGE電泳,半干轉(zhuǎn)至PVDF膜,以濃度為1：1500的一抗4℃過夜封閉、1：2000的二抗37℃封閉1小時,TBST洗膜后滴加ECL發(fā)光液顯影,用灰度值分析條帶,計算各組c-myc/PTEN基因的相對表達量。內(nèi)參為β-actin。10.CCK-8檢測細胞增殖取轉(zhuǎn)染24h后各組細胞,胰酶消化后接種到96孔板中,每孔1000個細胞,培養(yǎng)液200ul,每組接種4孔,分別于1至4天檢測細胞增殖情況。檢測時每孔加CCK-8試劑20ul,培養(yǎng)1.5小時后用酶標儀檢測各孔450nm吸光值,繪制生長曲線圖。每組設(shè)三個復孔,所有實驗重復3次。11.統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)描述為均數(shù)±標準差,用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析,取P＜0.05為有效檢驗值,兩組間采用t檢驗,多組間采用單因素方差分析。結(jié)果1.重組質(zhì)粒驗證菌落PCR產(chǎn)物電泳后可見條帶與插入片段大小一致；重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見質(zhì)粒大片段和插入的基因小片段兩條條帶,其中pmR-21重組載體小片段位于300bp與500bp之間,pmR-132重組載體小片段位于500bp與750bp之間,分別與pre-miR-21、pre-miR-132的PCR產(chǎn)物大小一致。最終測序證實pre-miR-21、pre-miR-132基因片段已經(jīng)插入pmR-mCherry質(zhì)粒中,pmR-21和pmR-132重組載體構(gòu)建成功。2.轉(zhuǎn)染24小時后熒光顯微鏡下觀察載體熒光蛋白表達效果鏡下觀察各組細胞形態(tài)正常,pmR-21和pmR-132重組載體組、空載體組觀察到紅色熒光。流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率大于50%�？瞻捉M無熒光。3. qPCR檢測miR-21相對表達量以空白組為1,轉(zhuǎn)染24h后,pmR-21重組載體組HepG2.2.15細胞中miR-21的相對表達量(18.88±2.35)高于空載體組(1.01±0.11),P0.01�？蛰d體組和空白組無差異。4. qPCR檢測miR-132相對表達量以空白組為1,轉(zhuǎn)染24h后,pmR-132重組載體組HepG2.2.15細胞中miR-21的相對表達量(20.10±2.29)高于空載體組(0.97±0.11),P0.01�？蛰d體組和空白組無差異。5.轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細胞培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg檢測pmR-21組轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細胞培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg高于空載組和空白組(P＜0.05),空載組和空白組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；pmR-132組轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細胞培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg低于空載組和空白組(P＜0.05),空載組和空白組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。6.轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)液上清HBV DNA拷貝數(shù)檢測轉(zhuǎn)染24h、48h、72h, pmR-21組細胞培養(yǎng)液上清DNA拷貝數(shù)均高于空載組和空白組(P＜0.05),空載組和空白組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)：在轉(zhuǎn)染24、48、72h后,pmR-132重組載體組HBV DNA定量低于空載體組和空白組,P＜0.01�？蛰d組和空白組無差異,P＞0.05。7. c-myc基因的mRNA檢測轉(zhuǎn)染24小時后,在內(nèi)參表達量相當?shù)那闆r下,空白組和空載體組c-myc mRNA表達量無明顯差異,pmR-21重組載體組c-myc mRNA表達量高于空白組和空載組,P0.05。8. PTEN基因mRNA水平檢測以空白組為對照,pmR-132重組載體組在轉(zhuǎn)染24小時后PTEN mRNA表達量高于其余兩組(P＜0.05),空載組與空白組無差異。9. c-myc基因的蛋白水平檢測western blot顯示,與空載體組和空白組對比,pmR-21重組載體組c-myc基因在轉(zhuǎn)染pmR-21重組載體72h表達升高(P＜0.05,與該基因mRNA檢測結(jié)果一致。10. PTEN基因的蛋白水平檢測pmR-132重組載體組PTEN基因在轉(zhuǎn)染pmR-132重組載體72h表達量升高(P＜0.05,空載組與空白組無差異(P＞0.05),與mRNA檢測結(jié)果一致。11.CCK-8檢測細胞增殖轉(zhuǎn)染后,pmR-21重組載體組細胞生長速度快于空載體組和空白組(P＜0.05),空白組和空載組無差異(P＞0.05)；pmR-132組細胞增殖速度慢于空載體組和空白組(P＜0.05),空白組和空載組無差異(P＞0.05)。結(jié)論1.miR-21和miR-132真核過表達載體pmR-21和pmR-132構(gòu)建成功。2.在HepG2.2.15細胞中,miR-21可促進HBV的復制和表達,促進c-myc基因的表達和細胞增殖。3.在HepG2.2.15細胞中,miR-132可抑制HBV的復制和表達,促進PTEN基因的表達并抑制細胞增殖。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62

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本文編號：1251727