本文關(guān)鍵詞：miR-21和miR-132在HepG2.2.15細(xì)胞中對(duì)慢性HBV感染及c-myc、PTEN基因表達(dá)的作用

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【摘要】：研究背景和目的HBV感染是世界性衛(wèi)生難題,據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2015年公布數(shù)據(jù),目前全球有2.4億慢性乙型肝炎患者,每年有超過78萬人死于由乙型肝炎所致肝硬化和肝癌等并發(fā)癥。目前HBV的治療主要依賴于干擾素和核苷酸類似物,不但未能完全清除HBV,且有一定的毒副作用及停藥易反跳、潛在耐藥性等缺點(diǎn)。而microRNA在感染方面的重要作用為進(jìn)一步研究HBV感染提供了新的方法。miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,成熟的miRNA通過形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC),調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。miRNA除了參與正常的生理過程外,還在感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展、心腦血管疾病等方面發(fā)揮重要的作用,為相關(guān)疾病的診治提供新的突破點(diǎn)。而miR-21和miR-132是近年發(fā)現(xiàn)與HBV感染相關(guān)的miRNA。miR-21參與肝臟損傷的修復(fù)過程,在急性肝衰竭、部分肝切除后miR-21表達(dá)升高,促進(jìn)正常肝細(xì)胞再生,但其本質(zhì)上是一種充當(dāng)促癌基因作用的miRNA,參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲過程。尤為特殊的是miR-21在與HBV、EB等病毒感染相關(guān)的癌癥中起促癌作用。miR-21在HBV相關(guān)性肝癌(HCC)中表達(dá)升高,目前研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過抑制促凋亡蛋白PTEN、Fas-L等抑癌基因的表達(dá),發(fā)揮促癌基因的作用。miR-21還可與HBx蛋白相互促進(jìn),參與HBV的感染過程。c-myc基因則是HBx發(fā)揮促癌作用的途徑之一。c-myc基因是較早發(fā)現(xiàn)的促癌基因之一,其蛋白可與DNA結(jié)合,通過多種機(jī)制促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。因此我們以可試圖進(jìn)一步明確miR-21在慢性HBV感染中對(duì)HBV復(fù)制、表達(dá)的影響,以及其在HBV相關(guān)性HCC中對(duì)c-myc基因表達(dá)的影響。miR-132廣泛參與多種細(xì)菌、病毒感染和腫瘤致病過程。既往在免疫細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),miR-132對(duì)病毒感染主要起促進(jìn)作用。miR-132表達(dá)升高可抑制巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄輔激活物p300 (transcriptional coactivator p300)的表達(dá),從而降低干擾素-y (IFN-γ)的表達(dá)。但在HBV感染相關(guān)肝癌(HCC)中,miR-132的表達(dá)被HBx抑制,且miR-132表達(dá)降低與HCC的發(fā)展相關(guān),提示miR-132在HBV感染中所起的作用可能與其在免疫細(xì)胞中不同。在HCC中,有研究證實(shí)miR-132能通過Akt/mTOR信號(hào)通路(Akt/Mtor signaling pathway)和Yes-associated protein (YAP)抑制癌細(xì)胞增殖。而PTEN基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)是Akt信號(hào)通路上游作用因子之一,其表達(dá)降低是HCC發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。Targetscan數(shù)據(jù)預(yù)測提示PTEN基因是miR-132的作用靶點(diǎn)之一。因此,進(jìn)一步探討miR-132在慢性HBV感染中對(duì)HBV復(fù)制、表達(dá)及PTEN基因的表達(dá)所起的作用是本研究的另一方面。研究方法1.pmR-21和pmR-132真核重組過表達(dá)載體的構(gòu)建通過miRBase數(shù)據(jù)庫分別查找pre-miR-21(miR-21前體)和pre-miR-132(miR-132前體)序列及其上下游各100bp側(cè)翼序列,用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物。提取HepG2.2.15細(xì)胞的DNA作為模板,用PCR擴(kuò)增前體序列。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后分別和pmR-mCherry質(zhì)粒用T4連接酶于16℃過夜連接。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α,進(jìn)行卡那霉素抗性平板篩選。16小時(shí)后挑取陽性菌落進(jìn)行菌落PCR和搖菌擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,以1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定重組載體正確性。最后選取電泳陽性組的菌株進(jìn)行測序鑒定。2.重組載體轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞和HepG2細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)于含15%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中(同時(shí)添加200 mg/L的G418、10 g/L L-谷氨酰胺以及100000 IU/L青鏈霉素),HegG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和100000 IU/L青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中,置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。取經(jīng)去內(nèi)毒素提取的重組載體和pmR-mCherry空質(zhì)粒按試劑盒操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分為pmR-21/pmR-132重組載體組、空載體組、空白組、HepG2陽性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染24h后在熒光顯微鏡下觀察載體熒光蛋白表達(dá)效果。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效果轉(zhuǎn)染24h后,用胰酶消化各組細(xì)胞,PBS清洗3次,用加樣槍輕輕吹勻后上機(jī)檢測,激發(fā)波長為480nm,檢測波長為620nm,設(shè)空白組為對(duì)照孔。4.miR-21和miR-132 qPCR相對(duì)定量檢測轉(zhuǎn)染24h后,收集各組細(xì)胞,提取總RNA,以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。以總RNA為模板,設(shè)計(jì)針對(duì)miR-21、miR-132成熟序列的特異性RT-PCR莖環(huán)引物(由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成),逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR,以U6為內(nèi)參。采用2-"俊鱟t相對(duì)定量分析方法檢測各組miR-21、miR-132的相對(duì)表達(dá)量。5.化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg取轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液(陽性對(duì)照組除外),1500rpm離心5min,吸取上清,用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測。6.培養(yǎng)液HBV DNA拷貝數(shù)檢測收集轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液(陽性對(duì)照組除外),1500rpm離心5min,按試劑盒操作處理樣品,用定量PCR儀檢測。每管設(shè)2個(gè)復(fù)孔。7. c-myc基因mRNA水平的RT-PCR檢測以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為CGTCCTCGGATTCTCTGCTC,下游引物為GCTGGTGCATTTTCGGTTGT。內(nèi)參為GAPDH,上游引物為：GCTCTCTGCTCCTCCTGT,下游引物為：ATGAGTCCTTCCACGATAC。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行灰度值分析。8. PTEN基因mRNA水平的RT-PCR檢測以總RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PTEN上游引物為：GGGGTGGAACTGTGCACTAA,下游引物為TAGGCTTTGAAGGACAGCAGG.內(nèi)參為GAPDH,引物同前述。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳和灰度值分析。9. c-myc/PTEN基因蛋白水平的western blot檢測在轉(zhuǎn)染72小時(shí)后提取各組細(xì)胞蛋白,BCA法測定蛋白濃度并調(diào)節(jié)各組蛋白樣品濃度至相等,變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,半干轉(zhuǎn)至PVDF膜,以濃度為1：1500的一抗4℃過夜封閉、1：2000的二抗37℃封閉1小時(shí),TBST洗膜后滴加ECL發(fā)光液顯影,用灰度值分析條帶,計(jì)算各組c-myc/PTEN基因的相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參為β-actin。10.CCK-8檢測細(xì)胞增殖取轉(zhuǎn)染24h后各組細(xì)胞,胰酶消化后接種到96孔板中,每孔1000個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)液200ul,每組接種4孔,分別于1至4天檢測細(xì)胞增殖情況。檢測時(shí)每孔加CCK-8試劑20ul,培養(yǎng)1.5小時(shí)后用酶標(biāo)儀檢測各孔450nm吸光值,繪制生長曲線圖。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔,所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。11.統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)描述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,取P＜0.05為有效檢驗(yàn)值,兩組間采用t檢驗(yàn),多組間采用單因素方差分析。結(jié)果1.重組質(zhì)粒驗(yàn)證菌落PCR產(chǎn)物電泳后可見條帶與插入片段大小一致；重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切后,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見質(zhì)粒大片段和插入的基因小片段兩條條帶,其中pmR-21重組載體小片段位于300bp與500bp之間,pmR-132重組載體小片段位于500bp與750bp之間,分別與pre-miR-21、pre-miR-132的PCR產(chǎn)物大小一致。最終測序證實(shí)pre-miR-21、pre-miR-132基因片段已經(jīng)插入pmR-mCherry質(zhì)粒中,pmR-21和pmR-132重組載體構(gòu)建成功。2.轉(zhuǎn)染24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察載體熒光蛋白表達(dá)效果鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)正常,pmR-21和pmR-132重組載體組、空載體組觀察到紅色熒光。流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率大于50%。空白組無熒光。3. qPCR檢測miR-21相對(duì)表達(dá)量以空白組為1,轉(zhuǎn)染24h后,pmR-21重組載體組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-21的相對(duì)表達(dá)量(18.88±2.35)高于空載體組(1.01±0.11),P0.01�？蛰d體組和空白組無差異。4. qPCR檢測miR-132相對(duì)表達(dá)量以空白組為1,轉(zhuǎn)染24h后,pmR-132重組載體組HepG2.2.15細(xì)胞中miR-21的相對(duì)表達(dá)量(20.10±2.29)高于空載體組(0.97±0.11),P0.01�？蛰d體組和空白組無差異。5.轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細(xì)胞培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg檢測pmR-21組轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細(xì)胞培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg高于空載組和空白組(P＜0.05),空載組和空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；pmR-132組轉(zhuǎn)染24h、48h、72h細(xì)胞培養(yǎng)液上清HBsAg和HBeAg低于空載組和空白組(P＜0.05),空載組和空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。6.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)液上清HBV DNA拷貝數(shù)檢測轉(zhuǎn)染24h、48h、72h, pmR-21組細(xì)胞培養(yǎng)液上清DNA拷貝數(shù)均高于空載組和空白組(P＜0.05),空載組和空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)：在轉(zhuǎn)染24、48、72h后,pmR-132重組載體組HBV DNA定量低于空載體組和空白組,P＜0.01。空載組和空白組無差異,P＞0.05。7. c-myc基因的mRNA檢測轉(zhuǎn)染24小時(shí)后,在內(nèi)參表達(dá)量相當(dāng)?shù)那闆r下,空白組和空載體組c-myc mRNA表達(dá)量無明顯差異,pmR-21重組載體組c-myc mRNA表達(dá)量高于空白組和空載組,P0.05。8. PTEN基因mRNA水平檢測以空白組為對(duì)照,pmR-132重組載體組在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后PTEN mRNA表達(dá)量高于其余兩組(P＜0.05),空載組與空白組無差異。9. c-myc基因的蛋白水平檢測western blot顯示,與空載體組和空白組對(duì)比,pmR-21重組載體組c-myc基因在轉(zhuǎn)染pmR-21重組載體72h表達(dá)升高(P＜0.05,與該基因mRNA檢測結(jié)果一致。10. PTEN基因的蛋白水平檢測pmR-132重組載體組PTEN基因在轉(zhuǎn)染pmR-132重組載體72h表達(dá)量升高(P＜0.05,空載組與空白組無差異(P＞0.05),與mRNA檢測結(jié)果一致。11.CCK-8檢測細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染后,pmR-21重組載體組細(xì)胞生長速度快于空載體組和空白組(P＜0.05),空白組和空載組無差異(P＞0.05)；pmR-132組細(xì)胞增殖速度慢于空載體組和空白組(P＜0.05),空白組和空載組無差異(P＞0.05)。結(jié)論1.miR-21和miR-132真核過表達(dá)載體pmR-21和pmR-132構(gòu)建成功。2.在HepG2.2.15細(xì)胞中,miR-21可促進(jìn)HBV的復(fù)制和表達(dá),促進(jìn)c-myc基因的表達(dá)和細(xì)胞增殖。3.在HepG2.2.15細(xì)胞中,miR-132可抑制HBV的復(fù)制和表達(dá),促進(jìn)PTEN基因的表達(dá)并抑制細(xì)胞增殖。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62

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