本文關(guān)鍵詞：SAMHD1抗乙肝病毒作用及IFN-α調(diào)控SAMHD1表達(dá)的機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景及目的SAMHD1(the sterile alpha motif and HD domain containing protein-1)2011年被發(fā)現(xiàn)是一個(gè)新的固有免疫抗病毒分子。SAMHD1通過降解宿主細(xì)胞內(nèi)d NTPs至低水平使逆轉(zhuǎn)錄病毒c DNA不能合成進(jìn)而抑制病毒復(fù)制。研究表明SAMHD1可以抑制逆轉(zhuǎn)錄病毒、DNA病毒的復(fù)制和內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座。而Ⅱ型艾滋病病毒(HIV-2)和猴免疫缺陷病毒(SIVsm/mac)輔助基因編碼的Vpx蛋白則能拮抗SAMHD1對病毒復(fù)制的抑制作用。乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是全球性的公共健康問題。我們國家是乙肝病毒感染高度流行的國家。乙肝病毒的生命周期過程中有一個(gè)與慢病毒類似的逆轉(zhuǎn)錄過程,然而SAMHD1是否可以在肝細(xì)胞中通過降解d NTPs來抑制HBV的復(fù)制尚不清楚。干擾素(Interferon,IFN)作為乙肝治療中一種常用的抗病毒藥物,可以誘導(dǎo)許多抗病毒蛋白表達(dá)從而抑制病毒的復(fù)制。IFN-α可以通過經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑誘導(dǎo)基因表達(dá)。經(jīng)典IFN-α信號(hào)通路通過干擾素刺激基因因子3(ISGF3)誘導(dǎo)基因表達(dá)。ISGF3包括STAT1、STAT2和IRF9。非經(jīng)典信號(hào)通路是STAT1非依賴的。至今,IFN-α在肝細(xì)胞中調(diào)控SAMHD1表達(dá)的機(jī)制尚不明確。本研究將探討SAMHD1對HBV復(fù)制的影響及IFN-α以何種途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞中SAMHD1表達(dá)。方法選取肝細(xì)胞系Hep G2、LO2、BEL-7402和SMMC-7721,使用Western Blot檢測SAMHD1內(nèi)源性表達(dá)水平,并用免疫熒光法驗(yàn)證。選擇兩株低表達(dá)SAMHD1的肝細(xì)胞BEL-7402和SMMC-7721,分別轉(zhuǎn)染p SAMHD1wt和p SAMHD1HD/AA,MTT檢測細(xì)胞的活性率。p HBVwt分別與p SAMHD1wt或p SAMHD1HD/AA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞,Western Blot檢測SAMHD1外源性表達(dá)情況。p HBVwt,p RL-TK分別與p SAMHD1wt或p SAMHD1 HD/AA共轉(zhuǎn)染SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞,48 h后,ELISA檢測細(xì)胞上清HBs Ag、HBe Ag含量,q RT-PCR檢測HBV核心相關(guān)DNA的水平。Hep G2細(xì)胞轉(zhuǎn)染p HBVwt和p HBV△X質(zhì)粒,Western Blot檢測SAMHD1蛋白表達(dá)水平。選取SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞,IFN-α以不同劑量和時(shí)間點(diǎn)處理肝細(xì)胞后,Western Blot和q RT-PCR檢測SAMHD1表達(dá)改變情況。選取IFN-α誘導(dǎo)的SMMC-7721細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染STAT1、STAT2和IRF9 si RNA下調(diào)相應(yīng)基因表達(dá)后,再用IFN-α刺激,Western Blot和q RT-PCR檢測IFN-α誘導(dǎo)SAMHD1表達(dá)是否受到抑制。結(jié)果在四株肝細(xì)胞系Hep G2、LO2、BEL-7402和SMMC-7721中,檢測到SAMHD1均有內(nèi)源性表達(dá);SAMHD1的外源性表達(dá)對肝細(xì)胞系無細(xì)胞毒作用;肝細(xì)胞SMMC-7721、BEL-7402中SAMHD1可以抑制HBV的復(fù)制;Hep G2細(xì)胞中HBV復(fù)制可以下調(diào)SAMHD1表達(dá);在肝細(xì)胞SMMC-7721、BEL-7402中IFN-α以時(shí)間和劑量依賴的方式上調(diào)SAMHD1蛋白表達(dá)水平;IFN-α處理的SMMC-7721細(xì)胞以時(shí)間依賴的方式在m RNA水平上調(diào)SAMHD1表達(dá);分別用特異性si RNAs下調(diào)STAT1、STAT2和IRF9基因表達(dá)后,SMMC-7721細(xì)胞中再加入IFN-α刺激10 h,IFN-α誘導(dǎo)的SAMHD1表達(dá)水平下降。結(jié)論1.SAMHD1在肝細(xì)胞內(nèi)可以抑制HBV復(fù)制;2.IFN-α在肝細(xì)胞中可以誘導(dǎo)SAMHD1表達(dá);3.IFN-α在SMMC-7721中通過ISGF3復(fù)合體誘導(dǎo)SAMHD1表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62

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