本文關(guān)鍵詞：分子診斷技術(shù)平臺的建立及其在呼吸道病毒與登革病毒檢測中的應(yīng)用

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【摘要】：目的1整合以核酸擴(kuò)增為原理的各種PCR技術(shù)(普通PCR、熒光定量PCR、多重PCR)和高通量基因測序技術(shù),建立既能快速篩查常見病毒,又有能力發(fā)現(xiàn)新發(fā)病毒的臨床病毒檢測體系,滿足醫(yī)療機(jī)構(gòu)用于常規(guī)檢驗(yàn)工作和公共衛(wèi)生單位應(yīng)對突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的需求。2建立常見呼吸道病毒篩查的多重PCR、病毒宏基因組學(xué)高通量基因測序平臺、腺病毒核酸通用及分型PCR檢測體系,探討其在呼吸系統(tǒng)感染病原學(xué)診斷上的應(yīng)用。3基于2014年廣州發(fā)生的嚴(yán)重登革熱疫情,自主建立登革病毒核酸檢測及分型技術(shù)體系,分析本次疫情流行的登革病毒型別和基因進(jìn)化特征、住院患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果,以了解本次疫情的流行病學(xué)特征；比較分子診斷技術(shù)和免疫學(xué)技術(shù)在登革熱臨床診斷中的應(yīng)用效果,以指導(dǎo)臨床合理選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目。方法1呼吸道病毒分子診斷平臺的建立及應(yīng)用1.1呼吸道病毒多重PCR檢測體系的建立及兒童急性鼻竇炎病毒譜的研究設(shè)計(jì)一套針對A型流感病毒(Influenza A, IFA)、B型流感病毒(Influenza B, IFB)、1-4型人副流感病毒(Human parainfluenza virus, HPIV),呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial virus, RSV),腺病毒(Adenovirus, ADV),鼻病毒(Rhinovirus, RV),腸道病毒(Enterovirus, EV),人偏肺病毒(Human metapneumovirus, HMPV),人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV),冠狀病毒OC43(Coronavirus OC43),冠狀病毒NL63 (CoronavirusNL63),冠狀病毒229E(Coronavirus 229E)共15種常見呼吸道病毒的多重PCR檢測體系,對259份兒科門診急性鼻竇炎(Acute rhino sinusitis, ARS)患兒、219份急性上呼吸道感染(Acute upper respiratory tract infection, AURI)患兒、86份對照兒童鼻拭子標(biāo)本進(jìn)行呼吸道病毒檢測。比較分析ARS組和AURI組患兒鼻部的呼吸道病毒分布情況,分析與急性鼻竇炎的相關(guān)性最高的病毒。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡方檢驗(yàn)。1.2呼吸道宏基因組高通量測序方法的建立及兒童重癥肺炎病原學(xué)的研究建立基于Ion Torrent/Proton平臺的呼吸道宏基因組高通量測序技術(shù),并對9份重癥肺炎患兒肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)標(biāo)本進(jìn)行宏基因組測序。獲得的測序讀長用BLASTn與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的基因組序列進(jìn)行比對,分析標(biāo)本中存在的病毒種類及豐度,對標(biāo)本中微生物的種類進(jìn)行定性與定量檢測。數(shù)據(jù)量足夠時使用Trinity軟件組裝病毒的全基因組序列,使用TVC和GATK兩種方法進(jìn)行SNPs及InDel突變的檢測,使用BioEdit7.0和MEGA6.0軟件進(jìn)一步做毒株的同源進(jìn)化分析。并比較NGS技術(shù)與PCR擴(kuò)增和傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定結(jié)果的一致性。1.3腺病毒通用及分型PCR檢測方法的建立及各亞型流行特征的研究設(shè)計(jì)針對腺病毒Hexon基因保守區(qū)的通用引物、探針以及3、4、7、14、21型腺病毒型特異性引物,建立人腺病毒檢測及分型的普通PCR和熒光定量PCR方法,對105份腺病毒核酸檢測陽性的兒童呼吸道感染標(biāo)本進(jìn)行基因分型,分析腺病毒各亞型在兒童呼吸道感染疾病中的分布情況。2登革熱分子診斷技術(shù)的建立及評估2.1登革病毒PCR檢測體系的建立及廣州登革疫情的流行病學(xué)研究設(shè)計(jì)1-4型登革病毒通用及型特異性的普通PCR和熒光定量PCR引物、探針,建立登革病毒核酸檢測及分型體系。并對2014年9月20日至2014年11年20日間于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診的登革熱住院患者的血清標(biāo)本進(jìn)行登革病毒檢測及分型,對病毒分離株的E、NS 1基因序列做進(jìn)化分析,開展登革病毒分子流行病學(xué)研究。2.2登革熱分子診斷與免疫學(xué)檢驗(yàn)方法的比較根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn),收集138名登革熱確診住院患者的254份血清樣本,并進(jìn)行病毒核酸(熒光定量PCR技術(shù))和登革病毒NS1抗原(ELISA).特異性抗體(層析免疫分析法)檢測。對診斷登革熱的分子生物學(xué)與免疫學(xué)方法進(jìn)行比較,觀察不同檢測指標(biāo)在病程中的變化規(guī)律,為合理使用登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷項(xiàng)目提供依據(jù)。2.32014年廣州登革熱住院患者臨床特征與檢驗(yàn)結(jié)果的分析收集138名登革熱住院患者的臨床資料,按照其感染的登革病毒血清型、發(fā)病程度(普通或重癥登革熱)進(jìn)行分組,比較不同組間皮疹、肌肉痛、惡心嘔吐、腹痛腹瀉等癥狀,白細(xì)胞、血小板、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸激酶等多項(xiàng)臨床檢驗(yàn)指標(biāo)的差異及其在發(fā)病期間的動態(tài)變化規(guī)律。成果1呼吸道病毒分子診斷整合平臺的建立及應(yīng)用1.1呼吸道病毒多重PCR檢測體系的建立及兒童急性鼻竇炎病毒譜的研究使用呼吸道多重PCR篩查體系從564份鼻拭子標(biāo)本中檢出179株(31.7%)病毒,ARS組(44.4%)、AURI組(27.4%)和對照組(4.7%)各組之間病毒檢出率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001,RR=2.116,95%CI=1.440～3.110)。RV的檢出率最高,在ARS組中有24例(9.3%),AURI組中9例(4.1%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,RR=2.27)；另外ARS組檢出腺病毒16例(6.2%),AURI組4例(1.6%)(P0.05,RR=3.374),其余病毒在兩組之間的檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1.2呼吸道宏基因組高通量基因測序方法的建立及兒童重癥肺炎病原學(xué)的研究成功利用呼吸道宏基因組高通量測序技術(shù)對重癥肺炎患者BALF標(biāo)本進(jìn)行病原檢測,結(jié)果顯示每份標(biāo)本中病毒、真菌、細(xì)菌的讀長序列所占比例各不相同。檢測出的主要病原體有7例ADV-7,其中一例是ADV-7和HPIV混合感染,MPV和H3N2甲型流感病毒各1例,同時共存有多種低豐度的其他病毒,如RSV, TT病毒,HPV, EBV,沙門達(dá)病毒。通過拼接與組裝獲得了4例7型ADV型病毒全基因組序列,相互之間相似度99.7%,且與近年來我國各地報道的7型腺病毒序列均高度相似(98.1%)。PCR擴(kuò)增結(jié)果為7例ADV、MPV和A型流感病毒各1例,與宏基因組測序結(jié)果基本一致,但漏檢了混合感染中的HPIVo宏基因測序檢測結(jié)果除去大量正常菌群外,檢出副流感嗜血桿菌、流感嗜血桿菌、黏液羅斯菌、大腸桿菌等；檢出2例肺炎支原體(Mycoplasma Pneumoniae,MP)和1例熱帶假絲酵母菌,與培養(yǎng)鑒定結(jié)果基本相同,但宏基因測序可獲得的細(xì)菌種類更全面,易發(fā)現(xiàn)兩種或兩種以上細(xì)菌混合感染。而在真菌鑒定方面,宏基因測序漏檢了1例白色假絲酵母菌,培養(yǎng)鑒定方法則誤將熱帶假絲酵母菌鑒定為釀酒酵母。1.3腺病毒通用及分型PCR檢測方法的建立及各亞型流行特征的研究本節(jié)設(shè)計(jì)的ADV通用PCR引物及探針,型特異性分型引物均能擴(kuò)增特異性產(chǎn)物,不同型之間無交叉反應(yīng)。105份陽性核酸標(biāo)本使用熒光定量PCR檢測均為陽性,而普通PCR只能檢測出87例(82.9%)。使用分型PCR對80份標(biāo)本進(jìn)行了腺病毒分型,其中ADV-3型檢出率最高共有50例(57.5%)、其次ADV-7型23例(26.4%)、ADV4型5例(5.7%)、ADV14型和21型各1例,分別占1.1%。但重癥肺炎患者中ADV-7型(66.7%)的檢出率高于ADV-3型(33.3%)。2登革熱分子診斷技術(shù)的建立及評估2.1登革病毒PCR檢測體系的建立及廣州登革疫情的流行病學(xué)研究本實(shí)驗(yàn)最終納入了138名登革熱住院患者,其中124例(89.9%)核酸檢測陽性,DENV-1型107例(77.5%),DENV-2型17例(12.3%)。流行病毒株的E、NS1基因進(jìn)化分析結(jié)果表明DENV-1和DENV-2毒株都與廣東省2006至2013年間流行的病毒株高度相似(99%)。2.2登革熱分子診斷與免疫學(xué)檢驗(yàn)方法的比較以首次發(fā)熱時間為病程第一天,vRNA核酸檢測陽性率在前五天均為100%,七天內(nèi)可維持在80%以上。NSl抗原檢測的陽性率在第三至第九天持續(xù)維持在90%以上。IgM抗體在第六日開始升高至80%；IgG抗體前8天陽性率在20%以下,后續(xù)可穩(wěn)定保持在80%以上。vRNA與NS1抗原檢測在八天內(nèi)的聯(lián)合診斷率達(dá)到100%；NS1抗原和抗體檢測在第七至十天的聯(lián)合診斷率為100%。2.3廣州登革熱住院患者臨床特征與檢驗(yàn)結(jié)果的分析所有登革熱患者均會出現(xiàn)高熱,其中約52.2%的患者出現(xiàn)肌肉、骨關(guān)節(jié)疼痛,31.2%出現(xiàn)明顯皮疹,(20～30)%的患者伴有不同程度的消化道癥狀,如惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等；病情嚴(yán)重者常出現(xiàn)意識障礙,多器官功能障礙,甚至休克、死亡。白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)都有明顯降低趨勢,白細(xì)胞均值在第五天降至最低值(2.85±1.6)/L,血小板均值在第七天左右到達(dá)最低(78±51.8)/L,ALT、AST、CK、LDH、D-Dimer在感染期間有升高趨勢,大部分患者的血Bun、Cr水平在感染期間無明顯變化。1、2型登革病毒感染患者的各項(xiàng)臨床癥狀的發(fā)生率與檢驗(yàn)結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而8例(5.8%)重癥登革熱患者中有6人(75%)出現(xiàn)意識障礙,2人(25%)出現(xiàn)休克,2入(25%)死亡。重癥登革熱組的平均住院時間(18.6+9.5天)及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果包括：PLT(29.6±27.2)/L、 ALT(138.3±164.6) U/L、AST(179.5±117.5)U/L、CK(1969.6±3821.5)U/L、 LDH(2743.3±6148.4)U/L、D-Dimer(5113.7±3962.9)ng/ml、Cr(276.4±426.6)umol/L、 BUN(10.0±7.5)mmol/L與普通登革熱患者組的結(jié)果相比均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：1呼吸道病毒分子檢測體系的建立與應(yīng)用研究本課題建立了中低通量的呼吸道病毒多重PCR篩查體系,能經(jīng)濟(jì)、快速的擴(kuò)增15種常見的呼吸道病毒,不僅可以滿足臨床常規(guī)檢測的需要,更是應(yīng)對突發(fā)傳染病快速篩查病原體的重要工具,當(dāng)常規(guī)檢測無法找到明確的病原體時,我們建立的宏基因組測序方法將以其不依賴特異性擴(kuò)增的技術(shù)特點(diǎn),及時檢測出新發(fā)、再現(xiàn)的或者發(fā)生明顯變異的病毒,同時還能獲得標(biāo)本中所有微生物種類及相對含量、從原位標(biāo)本中獲得病毒全基因組序列及毒株突變位點(diǎn)的信息,在臨床病毒的診斷、研究,急性突發(fā)性傳染病的檢測和監(jiān)控等方面都用重要的應(yīng)用前景。本課題應(yīng)用該檢測體系發(fā)現(xiàn)感染呼吸道病毒會增加兒童患鼻竇炎的幾率,其中RV和ADV與兒童急性鼻竇炎的發(fā)病關(guān)系最緊密。兒童重癥肺炎病原學(xué)的研究結(jié)果顯示,ADV-7型是主要的病原體,并且易引起細(xì)菌、真菌或MP的混合感染,ADV-7基因序列保守,本次獲得的四株7型腺病毒高度相似,結(jié)合我國多地的病例報道,提示ADV-7引起的重癥感染在我國多地散發(fā)。但是,通過自主建立的腺病毒通用及分型PCR核酸檢測體系對各亞型腺病毒的流行特點(diǎn)的分析,發(fā)現(xiàn)廣州地區(qū)腺病毒的流行主要以3型為主,但在重癥肺炎病例中ADV-7型的陽性率明顯高于3型。7型腺病毒在下呼吸道的致病性可能高于上呼吸道,是引起兒童重癥肺炎極為重要和關(guān)心的病原體,但其關(guān)鍵性的致病因素尚未研究清楚。2登革熱分子診斷技術(shù)的建立及評估本課題初步建立了登革病毒PCR及熒光定量PCR通用檢測及分型體系,通過核酸分型檢測以及對E、NS1基因序列的進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)此次疫情共有兩型登革病毒(DENV-1,DENV-2)流行,兩種血清型的毒株都與廣東省近年來的多株病毒十分接近。經(jīng)過多年散發(fā)流行和輸入病例的積累,廣東可能已經(jīng)形成了DENV-1, DENV-2的地方性傳播。2014年廣州登革疫情中由1、2型DENV感染的病例在臨床表現(xiàn)上無差異,而重癥登革熱患者相較普通患者血小板降低更加顯著,出現(xiàn)明顯的心、肝、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷,需要更長時間進(jìn)行住院治療,各種檢驗(yàn)結(jié)果對登革熱患者病情程度的判斷有重要作用,可幫助患者及時獲得對癥治療,降低病死率。核酸檢測是登革熱早期診斷最佳的方法。NSl在早期的靈敏度略低于核酸檢測,但持續(xù)的時間較長。而抗體檢測則在病程后期有重要的診斷作用。以患者首次發(fā)熱作為病程第一天,八天內(nèi)建議采用核酸檢測結(jié)合NSl抗原檢測,第七至十天推薦選擇NS1抗原結(jié)合抗體篩查,十天之后則應(yīng)以抗體篩查為主,合理選擇檢驗(yàn)項(xiàng)目將直接影響診斷的準(zhǔn)確性。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R440;R512.8

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 郭鵬娟;甘標(biāo);詹希美;;登革熱實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展[J];中國公共衛(wèi)生管理;2013年05期

2 林立;李昌崇;;“兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)”解讀[J];中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志(電子版);2014年06期

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本文編號：1143332