本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白TB10.4-Hspl6.3納米金生物傳感器診斷結(jié)核病的研究

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【摘要】：目的：克隆并表達(dá)結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3,分析其診斷結(jié)核病的價(jià)值；并建立基于重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3診斷結(jié)核病的納米金生物傳感器,為結(jié)核病的血清學(xué)診斷提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)支持。方法：(1)根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌TB10.4、Hsp16.3的基因序列設(shè)計(jì)并合成引物,以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模版,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增TB10.4和Hsp16.3的基因片段,重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增融合基因TB10.4-Hsp16.3,克隆至pMD18-T載體,菌落PCR和測(cè)序鑒定,將序列正確的融合基因TB10.4-Hsp16.3亞克隆至表達(dá)載體pET28a(+), PCR和雙酶切鑒定陽(yáng)性重組子。(2)將重組DNA轉(zhuǎn)化E.coli BL21,篩選陽(yáng)性菌株,異丙基p-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白TB10.4-Hsp16.3,超聲裂解菌體,對(duì)包涵體進(jìn)行變性溶解和復(fù)性,His-bindTM柱層析(Ni2+-NTA)純化重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3, Western blot分析其免疫學(xué)活性,ELISA評(píng)價(jià)其診斷結(jié)核病的價(jià)值。(3)晶種成長(zhǎng)法制備金納米棒,經(jīng)MUA、EDC、NHS化學(xué)修飾后,與融合蛋白TB10.4-Hsp16.3連接,構(gòu)建納米金生物傳感器,評(píng)價(jià)其對(duì)結(jié)核病的診斷價(jià)值。結(jié)果：(1)成功獲得約750bp的融合基因TB10.4-Hsp16.3,構(gòu)建了融合蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-TB10.4-Hsp16.3。(2)表達(dá)、純化獲得分子量約29kDa的融合蛋白TB10.4-Hsp16.3,能被結(jié)核病患者血清特異識(shí)別；其ELISA診斷結(jié)核病的靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、診斷效率依次為89.3%、90.7%、90.9%、89.1%、90.0%。(3)構(gòu)建了基于融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的納米金生物傳感器,其診斷結(jié)核病的靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、診斷效率分別為83.9%、85.2%、85.5%、83.6%、84.5%。結(jié)論：(1)采用重組DNA技術(shù)獲得了結(jié)核分枝桿菌重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3。(2)融合蛋白TB10.4-Hsp16.3具有良好的免疫活性,可用于結(jié)核病的診斷。(3)基于融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的納米金生物傳感器對(duì)結(jié)核病具有較好的診斷價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 融合蛋白 納米金生物傳感器 診斷 結(jié)核病
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R52;TP212.3
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 1. 引言11-13
• 2. 材料與方法13-33
• 2.1 菌種和血清13
• 2.2 試劑13-15
• 2.3 主要儀器15-16
• 2.4 主要溶液的配制16-23
• 2.5 方法23-33
• 3. 結(jié)果33-43
• 3.1 融合基因TB10.4-Hsp16.3的擴(kuò)增33
• 3.2 融合基因TB10.4-Hsp16.3的克隆與鑒定33-34
• 3.3 重組TB10.4-Hsp16.3表達(dá)載體的構(gòu)建34-35
• 3.4 重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的誘導(dǎo)表達(dá)35
• 3.5 重組融合蛋白TB 10.4-Hsp16.3的純化35
• 3.6 重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的免疫活性分析35-36
• 3.7 重組融合蛋白TB10.4-Hsp16.3的蛋白含量測(cè)定36
• 3.8 棋盤滴定法確定包被抗原-抗體最佳工作濃度36-37
• 3.9 重組TB10.4-Hsp16.3的ELISA檢測(cè)結(jié)核病人血清抗體37-38
• 3.10 金納米棒的制備38
• 3.11 金納米棒表面的抗原修飾38-39
• 3.12 納米金生物傳感器的血清學(xué)檢測(cè)39-40
• 3.13 TB10.4-Hsp16.3的ELISA和納米金生物傳感器檢測(cè)結(jié)果比較40-43
• 4. 討論43-49
• 5. 結(jié)論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 綜述57-73
• 參考文獻(xiàn)66-73
• 中英文縮略對(duì)照表73-75
• 附錄75-77
• 致謝77-79

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本文編號(hào)：1080219