發(fā)布時間：2021-07-13 04:23

　　目的：構(gòu)建攜帶人激肽釋放酶（KK）基因的重組腺相關(guān)病毒載體，測定其感染滴度，并觀察以不同滴度的病毒感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞后KK基因的表達差異。探討通過腺相關(guān)病毒載體導(dǎo)入KK基因治療高血壓的可行性。 方法：1、將人激肽釋放酶（KK）基因定向克隆入腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-MCS中構(gòu)建成pAAV／KK。2、pAAV／KK和另外兩種質(zhì)粒pHelper、pAAV-RC通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，包裝成帶有目的基因的重組病毒。收集病毒顆粒，同時以pAAV-LacZ作為報告基因和pHelper、pAAV-RC三種質(zhì)粒在和pAAV／KK完全相同的條件下共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，通過β-半乳糖苷酶染色測定轉(zhuǎn)染率，收集病毒原液。以不同稀釋梯度的病毒感染HT-1080細胞，通過β-半乳糖苷酶染色測定病毒滴度。3、以不同滴度的病毒分別感染體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細胞株（HUVEC）。培養(yǎng)72小時后，RT-PCR定量檢測KK在該細胞中表達。 結(jié)果：1、成功構(gòu)建了重組AAV人激肽釋放酶載體，2、藉β-半乳糖苷酶原位染色法檢測報告基因LacZ在人纖維肉瘤細胞（HT1080）中的表達測得重組病毒滴度... 

【文章來源】：福建醫(yī)科大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

堵喬田AAV一293細胞X200293細胞呈多角形，貼壁較疏松，細胞之間相互連成網(wǎng)狀，并有聚集成團的傾向

共轉(zhuǎn)染照片DNA:脂質(zhì)體=6:6(ug:ul)X100(該比例下藍染的細胞最多)

共轉(zhuǎn)染照片藍染的細胞即為包裝有重組腺相關(guān)病毒的細胞(處)DNA::ugulX0

【參考文獻】：
期刊論文
[1]腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)的人內(nèi)皮抑素的體外表達及對內(nèi)皮細胞抑制作用的研究[J]. 高雪軍,伍志堅,吳小兵,封多佳,侯云德.  病毒學(xué)報. 2002(03)
[2]人組織型激肽釋放酶基因降低果糖誘導(dǎo)高血壓大鼠的血壓并改善高胰島素血癥[J]. 趙春霞,汪培華,李宏偉,肖嘯,Lee Chao,汪道文.  中國分子心臟病學(xué)雜志. 2002(04)



本文編號：3281337