本文關(guān)鍵詞：原代肝細胞模型的優(yōu)化及苯乙烯和氧化苯乙烯的毒性研究

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【摘要】：目的建立具有高活力、高功能特性的原代小鼠肝細胞模型,并通過該體外模型評價受試物苯乙烯和氧化苯乙烯的急性毒性。方法以BABL/C小鼠作為肝細胞供者,在經(jīng)典兩步膠原酶消化法基礎(chǔ)上進行優(yōu)化,通過逆向灌流、間斷灌注、限制消化時間及Percoll液離心純化的方式獲取小鼠肝細胞,并進行體外單層和夾層培養(yǎng);通過細胞形態(tài)、細胞活力、胞內(nèi)糖原顆粒以及上清中各指標即白蛋白(ALB)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及尿素氮(BUN)變化綜合評價原代培養(yǎng)的肝細胞模型;以苯乙烯和氧化苯乙烯為受試物,用濃度分別為0.2、1、5、10和25μmol/L的受試物作用于夾層培養(yǎng)3 d的肝細胞,于染毒3、6、12、24及48 h后,采用CCK-8法和LDH法測定細胞存活率。結(jié)果改良法分離獲取的小鼠肝細胞活力為(90.3±5.2)%,純度為(95.3±4.2)%,產(chǎn)量達(2.4±0.9)×107;夾層培養(yǎng)7 d內(nèi)90%以上細胞呈典型的肝細胞形態(tài)特征,培養(yǎng)第3 d胞漿內(nèi)可見大量糖原顆粒。ALB分泌、LDH和ALT漏出、BUN合成、以及細胞活力夾層培養(yǎng)在8 d內(nèi)、單層培養(yǎng)在6 d內(nèi)呈波動性變化,且夾層培養(yǎng)法各指標明顯優(yōu)于單層培養(yǎng)法;夾層培養(yǎng)第3 d ALB分泌量[(1.42±0.20)g/L]和BUN合成量[(1.97±0.22)mmol/L]及細胞活力均達峰值,而LDH漏出量[(7.30±2.33)U/L]和ALT漏出量[(6.51±1.86)U/L]降到谷值,且3~7 d各指標變化相對穩(wěn)定。苯乙烯和氧化苯乙烯在染毒6 h內(nèi),對肝細胞顯示了較低的細胞毒性,細胞存活率在90%以上,且CCK-8和LDH兩種毒性測定方法之間無顯著差異;隨著染毒時間的進一步延長,CCK-8法檢測出的細胞存活率更低(85%以下),與LDH法相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用不同濃度受試物處理肝細胞24 h后,從5μmol/L開始觀察到相對較高的細胞毒性,用CCK-8法檢測出細胞存活率約為85%,但與LDH法相比無顯著差異;隨著染毒濃度的繼續(xù)增加,CCK-8法檢測出的細胞存活率更低(80%以下),與LDH法相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論改良的膠原酶消化法結(jié)合夾層培養(yǎng)法可使肝細胞在較長時間(7 d)內(nèi)維持良好的形態(tài)和功能,且用夾層培養(yǎng)3~7 d的肝細胞模型可以較準確地評價苯乙烯和氧化苯乙烯的毒性效應(yīng),結(jié)合毒性檢測指標推測受試物主要影響肝細胞內(nèi)線粒體亞細胞器的功能,對肝細胞膜的損傷程度影響較弱。
【作者單位】： 中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所 中國疾病預(yù)防控制中心化學(xué)污染與健康安全重點實驗室;
【關(guān)鍵詞】： 肝細胞 原代培養(yǎng) 苯乙烯 氧化苯乙烯 膠原酶 細胞毒性
【基金】：“十二五”國家科技支撐計劃(No.2014BAI12B02) 中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所青年科技基金(No.2014YS02,2015YS01)
【分類號】：R114;R329.2
【正文快照】： 近年來,隨著環(huán)境中新化學(xué)物質(zhì)種類和數(shù)量的日益增多,以動物為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)毒理學(xué)評價方法面臨著嚴峻挑戰(zhàn),同時隨著實驗動物3R原則(減少、優(yōu)化、替代)的倡導(dǎo)與實施、動物福利和倫理的重視以及生物醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)變,建立相對快速、簡單、可靠的體外評價化學(xué)物毒性的方法已成為當前毒

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