本文關(guān)鍵詞：靶向MA104細(xì)胞多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白shRNA慢病毒干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

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【摘要】：目的構(gòu)建靶向MA104細(xì)胞多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干擾質(zhì)粒,并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法根據(jù)Gen Bank中登錄的PTB的基因序列設(shè)計(jì)并合成2條靶向MA104細(xì)胞PTB基因的shRNA干擾序列(shPTB1、shPTB2)和1條陰性對(duì)照序列(shControl),分別插入載體p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,構(gòu)建慢病毒重組質(zhì)粒;利用HEK293Ta細(xì)胞包裝針對(duì)PTB基因的shRNA的重組慢病毒顆粒;感染MA104細(xì)胞后,經(jīng)Resl-time PCR、免疫熒光和Western blot法分別檢測MA104細(xì)胞中PTB基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 PCR及測序鑒定證明3種重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建正確。3種重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后,均可見綠色熒光表達(dá),3組細(xì)胞的病毒滴度均為2×106 TU/ml。3種重組慢病毒感染MA104細(xì)胞48 h后均可見綠色熒光表達(dá)。經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A組MA104細(xì)胞僅有少量細(xì)胞于細(xì)胞核中表達(dá),p LVshPTB1-EGFP-2A組MA104細(xì)胞中PTB基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A組。結(jié)論成功構(gòu)建了靶向MA104細(xì)胞PTB蛋白的shRNA重組慢病毒,shRNA序列可成功下調(diào)PTB在MA104細(xì)胞中的表達(dá),為PTB在RV增殖過程中調(diào)控作用的研究奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： MA細(xì)胞 多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白 慢病毒質(zhì)粒 RNA干擾
【基金】：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014BC008) “協(xié)和青年基金資助” “中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助”(33320140082)
【分類號(hào)】：R373
【正文快照】： 輪狀病毒(rotavirus,RV)是引起嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的主要病原體之一。RV具有季節(jié)流行性和嬰幼兒易感性等特點(diǎn),雖然已有相應(yīng)的疫苗可預(yù)防和控制RV感染,但每年全球由于RV感染引起的兒童腸胃炎病例數(shù)仍達(dá)約1.25億,導(dǎo)致約40萬例5歲以下兒童死亡[1]。目前,RV的感染敏感性機(jī)制尚不明確,，

本文編號(hào)：664426