本文關(guān)鍵詞：沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB方抗體的制備及其對(duì)NF-κB通路的影響

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【摘要】：目的:沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv B編碼產(chǎn)物具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶作用,與細(xì)菌毒力關(guān)系密切,目前該基因的功能還有很多未知。本研究第一部分通過(guò)對(duì)沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv B進(jìn)行生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)并制備相應(yīng)抗體,為后續(xù)深入研究該基因的功能提供工具和手段。第二部分通過(guò)建立沙門菌感染的巨噬細(xì)胞模型,研究spv B對(duì)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白IκBα和p65等表達(dá)的影響;利用與真核表達(dá)載體連接的重組質(zhì)粒p EGFP-N1-Spv B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,進(jìn)一步分析spv B對(duì)NF-κB通路的影響,探討該基因?qū)λ拗骶玖τ绊懙姆肿訖C(jī)制。方法:一.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv B的原核表達(dá)及其抗體的制備1.通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析spv B基因及其編碼的蛋白,選取抗原性較高、易表達(dá)的氨基酸序列作為克隆序列。2.根據(jù)spv B基因序列設(shè)計(jì)引物,以攜帶spv B基因的野生型鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.typhimurium,STM)為模板,PCR擴(kuò)增獲得目的片段后與原核表達(dá)載體p ET-28a連接,將質(zhì)粒p ET28a-Spv B轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化。用Spv B蛋白免疫健康小鼠,制備抗Spv B多克隆抗體,Western blot檢測(cè)抗體特異性。二.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv B對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響1.以攜帶spv B基因的鼠傷寒沙門菌野生株STM-WT、消除spv B基因的突變株STM-Δspv B及回補(bǔ)株STM-c-Δspv B分別與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞J774A.1共培養(yǎng),建立細(xì)胞感染模型。Western blot檢測(cè)NF-κB通路相關(guān)蛋白IκBα和p65等的表達(dá);熒光顯微鏡下觀察p65的核轉(zhuǎn)運(yùn);Western blot檢測(cè)Caspase-3的活化;比色法測(cè)定Caspase-3的活性;免疫共沉淀法檢測(cè)IκBα的泛素化水平。2.利用p RL-TK(內(nèi)參質(zhì)粒)、p NFκB-luc(報(bào)告基因質(zhì)粒)、p EGFP-N1及p EGFP-N1-Spv B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,加入TNF-α刺激后,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)spv B對(duì)NF-κB通路的影響;利用p EGFP-Spv B真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,TNF-α刺激后,Western blot檢測(cè)spv B基因?qū)κBα、p65等蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:一.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv B抗體的制備1.成功構(gòu)建p ET28a-Spv B原核表達(dá)重組質(zhì)粒,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)結(jié)果顯示,重組蛋白表達(dá)且主要存在于包涵體中。2.將純化的Spv B蛋白免疫小鼠,制備多克隆抗體,經(jīng)Western blot驗(yàn)證該抗體能特異結(jié)合Spv B蛋白。二.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv B對(duì)NF-κB通路的影響1.Western blot檢測(cè)NF-κB通路相關(guān)蛋白IκBα和p65的表達(dá),結(jié)果顯示細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后,STM-Δspv B感染組細(xì)胞IκBα的表達(dá)量顯著低于STM-WT感染組(P0.01),與STM-c-Δspv B感染組相比兩組間無(wú)顯著性差異(P0.05);感染4 h后,STM-Δspv B感染組IκBα的表達(dá)量顯著低于STM-WT和STM-c-Δspv B感染組(P0.01);感染4 h和8 h后,STM-Δspv B感染組Phospho-p65的表達(dá)水平高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染組(P0.05)。2.熒光顯微鏡下觀察p65的核轉(zhuǎn)運(yùn),結(jié)果顯示感染8 h后,STM-Δspv B感染組細(xì)胞核中p65的表達(dá)顯著高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染組。3.Western blot檢測(cè)Caspase-3的激活,結(jié)果顯示感染4 h和8 h后,STM-WT和STM-c-Δspv B感染組細(xì)胞Caspase-3出現(xiàn)明顯的活化;比色法測(cè)定Caspase-3的活性,結(jié)果顯示感染4 h和8 h后,STM-WT和STM-c-Δspv B感染組細(xì)胞Caspase-3活性高于STM-Δspv B感染組(p0.01)。4.免疫共沉淀檢測(cè)IκBα的泛素化水平,結(jié)果顯示用蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞24 h,細(xì)菌與細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后,STM-Δspv B感染組IκBα的泛素化水平高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染組,而未經(jīng)MG132處理各組間IκBα的泛素化差異不明顯。5.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)spv B對(duì)NF-κB通路的影響,結(jié)果顯示p EGFP-N1或p EGFP-N1-Spv B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞24 h,TNF-α處理后,p EGFP-N1-Spv B轉(zhuǎn)染組NF-κB的激活程度顯著低于p EGFP-N1轉(zhuǎn)染組(P0.01);p RL-TK、p NFκB-luc轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞24 h,三株受試菌感染細(xì)胞20 h后,STM-Δspv B感染組NF-κB的激活程度顯著高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染組(P0.01)。6.Western blot檢測(cè)spv B基因?qū)κBα和p65等蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示利用p EGFP-N1-Spv B真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染He La細(xì)胞,TNF-α處理后,p EGFP-N1-Spv B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Phospho-p65的表達(dá)顯著低于p EGFP-N1轉(zhuǎn)染組(P0.01)而IκBα的表達(dá)顯著高于p EGFP-N1轉(zhuǎn)染組(P0.01)。結(jié)論:1.成功構(gòu)建Spv B原核表達(dá)載體,獲得具有抗原性的Spv B蛋白及其多克隆抗體,為后續(xù)深入研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。2.利用沙門菌感染巨噬細(xì)胞和真核表達(dá)載體p EGFP-N1-Spv B轉(zhuǎn)染的He La細(xì)胞模型,證實(shí)spv B抑制NF-κB通路的激活,為進(jìn)一步探索spv B基因影響細(xì)菌毒力的分子機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門菌 毒力基因spvB 抗體 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-16
• 第一部分 沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB的原核表達(dá)及其抗體的制備16-31
• 1. 材料與方法16-25
• 1.1 材料16-20
• 1.2 方法20-25
• 2. 結(jié)果25-29
• 2.1 spvB的一般生物信息學(xué)特征25-26
• 2.2 spvB基因的PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)載體的構(gòu)建26-27
• 2.3 SpvB蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)27-28
• 2.4 SpvB蛋白的純化及鑒定28-29
• 2.5 SpvB多克隆抗體的鑒定29
• 3. 討論29-31
• 第二部分 沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響31-50
• 1. 材料與方法33-40
• 1.1 材料33-34
• 1.2 方法34-40
• 2. 結(jié)果40-47
• 2.1 平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)胞內(nèi)活菌數(shù)40
• 2.2 Western blot檢測(cè)IκBα、p65、Phospho-p65 蛋白的表達(dá)40-41
• 2.3 熒光顯微鏡下觀察p65 在細(xì)胞中的定位41-42
• 2.4 免疫共沉淀檢測(cè)IκBα的泛素化水平42-43
• 2.5 Western blot和比色法檢測(cè)Caspase-3 的活性43-44
• 2.6 真核表達(dá)載體pEGFP-N1-SpvB的構(gòu)建及鑒定44
• 2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)spvB對(duì)NF-κB通路的影響44-46
• 2.8 Western blot檢測(cè)spvB對(duì)NF-κB通路的影響46-47
• 3. 討論47-50
• 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 綜述 模式生物酵母在自噬研究中的應(yīng)用55-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表論文65-66
• 本課題所獲的基金資助66-67
• 英文縮略詞表67-68
• 致謝68-70

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1 樸春麗;于淼;姜U，

本文編號(hào)：664003