本文關(guān)鍵詞：EV71-CA16聯(lián)合滅活疫苗免疫保護(hù)效果研究

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【摘要】：目的：利用腸道病毒71型-柯薩奇病毒A組16型(EV71-CA16)聯(lián)合滅活疫苗,對(duì)動(dòng)物體內(nèi)和體外的保護(hù)效果進(jìn)行研究。嘗試用致敏的T淋巴細(xì)胞通過(guò)腹腔過(guò)繼回輸?shù)姆椒ń⑦^(guò)繼免疫乳鼠模型,對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)與保護(hù)作用之間的關(guān)系進(jìn)行探索性研究。方法：用Vero細(xì)胞培養(yǎng)疫苗候選株EV71-KM和CA16-KM,病毒收獲后經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活,A1(OH)3佐劑吸附,制成實(shí)驗(yàn)性疫苗。實(shí)驗(yàn)性疫苗分別于第0和14天經(jīng)肌肉注射免疫8周齡ICR雌鼠,100μ1/只,聯(lián)合免疫組免疫劑量分為：EV71 256EU+CA16 32EU組、EV71 256EU+CA16 320EU組與EV71 256EU+CA16 960EU組,對(duì)照組注射等體積PBS,第一次免疫后1h與雄鼠合籠,隨其交配,分娩后24h內(nèi)采集母鼠和乳鼠的血液用于血清中和抗體滴度的檢測(cè)；同時(shí)用100LD50強(qiáng)毒株(EV71-CC, CA16-CC)經(jīng)顱內(nèi)注射進(jìn)行攻毒,連續(xù)21天觀察其臨床癥狀與死亡情況,評(píng)價(jià)聯(lián)合疫苗對(duì)乳鼠的保護(hù)作用。用CA16-KM滅活疫苗(抗原含量為32EU/100μl)經(jīng)腹腔注射免疫1日齡SPF級(jí)ICR乳鼠2次,間隔2周,40山/只,對(duì)照組注射等體積PBS,末次免疫后第7天,以安樂(lè)法處死小鼠,無(wú)菌條件下取出脾臟,分選脾臟單個(gè)核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞,將分選的細(xì)胞經(jīng)腹腔注射回輸1日齡乳鼠,回輸2h后用強(qiáng)毒株(CA16-CC)經(jīng)顱內(nèi)注射攻擊,連續(xù)21天觀察其臨床癥狀與死亡情況,評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫反應(yīng)與保護(hù)作用之間的關(guān)系。結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組未檢測(cè)到血清特異性中和抗體；EV71-KM滅活疫苗和CA16-KM滅活疫苗之間沒(méi)有交叉保護(hù)作用。兩種疫苗單獨(dú)免疫雌鼠能夠完全保護(hù)其新生乳鼠抵抗相應(yīng)病毒致死劑量的攻擊；聯(lián)合免疫時(shí),EV71 256EU+CA16 32EU劑量組,對(duì)EV71的保護(hù)率為100%,對(duì)CA16的保護(hù)率及EV71和CA16同時(shí)攻毒的保護(hù)率為0%； CA16免疫劑量提高到320EU時(shí),對(duì)EV71和CA16同時(shí)攻毒總的保護(hù)率為30%；對(duì)EV71的保護(hù)率為100%,對(duì)CA16保護(hù)率為67%。CA16免疫劑量提高到960EU時(shí),對(duì)兩個(gè)病毒同時(shí)攻擊的保護(hù)率為70%,對(duì)EV71和CA16分別攻擊的保護(hù)率均達(dá)到100%,,對(duì)照組的保護(hù)率為0%。CA16滅活疫苗免疫組小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞以2×107/只回輸ICR乳鼠,對(duì)CA16攻擊產(chǎn)生100%的保護(hù)；免疫組T細(xì)胞以1×107/只回輸ICR乳鼠,對(duì)CA16攻擊產(chǎn)生60%的保護(hù)；免疫組B細(xì)胞以1×107/只回輸ICR乳鼠,對(duì)CA16的攻擊產(chǎn)生56%的保護(hù)；免疫組CD4+T和CD8+T細(xì)胞以5.0x106/只回輸裸乳鼠、免疫組記憶性T細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞以2.0x105/只回輸裸乳鼠后對(duì)病毒攻擊均無(wú)保護(hù),對(duì)照組對(duì)病毒攻擊均無(wú)保護(hù)。結(jié)論：EV71-CA16聯(lián)合免疫動(dòng)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)兩種病毒的免疫反應(yīng)。EV71 256EU在與三個(gè)CA16不同配比劑量組中均可產(chǎn)生完全保護(hù)；CA16低劑量組沒(méi)有有保護(hù)作用,提高劑量后,保護(hù)率也提高。致敏的脾臟單個(gè)核細(xì)胞過(guò)繼回輸至新生乳鼠體內(nèi)可完全保護(hù)其抵抗CA16的攻擊。致敏的T細(xì)胞、B細(xì)胞過(guò)繼回輸至新生乳鼠體內(nèi)可在一定程度上部分保護(hù)其抵抗CA16的攻擊。
【關(guān)鍵詞】：EV71-CA16聯(lián)合滅活疫苗 保護(hù)效果 乳鼠 過(guò)繼回輸 細(xì)胞免疫
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-15
• 1 EV71和CA16預(yù)防性疫苗的研究11-13
• 2 疫苗有效性的評(píng)價(jià)方法13-15
• 第一部分 試驗(yàn)用EV71-CA16聯(lián)合滅活疫苗的制備15-26
• 一、實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 二、實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 1 Vero細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)17-18
• 2 疫苗候選株EV71-KM、CA16-KM的培養(yǎng)18
• 3 熒光PCR法鑒定EV71-KM、CA16-KM病毒株18-19
• 4 EV71-KM、CA16-KM病毒株滴度的測(cè)定19-20
• 5 實(shí)驗(yàn)用滅活疫苗的制備20
• 6 EV71-KM、CA16-KM病毒株滅活后殘余毒力的測(cè)定20
• 7 EV71-KM、CA16-KM病毒株滅活后抗原含量的測(cè)定20-22
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-24
• 1 細(xì)胞狀態(tài)22
• 2 EV71-KM、CA16-KM病毒株的熒光PCR鑒定結(jié)果22-23
• 3 EV71-KM、CA16-KM病毒株CCID_(50)的測(cè)定結(jié)果23
• 4 EV71-KM、CA16-KM病毒株滅活后殘余毒力的檢測(cè)結(jié)果23
• 5 EV71-KM、CA16-KM病毒株滅活后抗原含量的測(cè)定結(jié)果23-24
• 四、討論24-25
• 五、小結(jié)25-26
• 第二部分 EV71-CA16聯(lián)合滅活疫苗對(duì)小鼠保護(hù)作用的研究26-43
• 一、實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 二、實(shí)驗(yàn)方法28-32
• 1 Vero細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)28
• 2 攻擊毒EV71-CC、CA16-CC的培養(yǎng)28
• 3 熒光PCR法鑒定EV71-CC、CA16-CC病毒株28
• 4 EV71-CC、CA16-CC病毒株滴度的測(cè)定28-29
• 5 EV71-CC、CA16-CC病毒株LD_(50)的測(cè)定29
• 6 免疫方案的研究29-30
• 7 EV71-KM和CA16-KM滅活疫苗的交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)30-31
• 8 EV71-CA16聯(lián)合滅活疫苗對(duì)新生乳鼠的保護(hù)作用31
• 9 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)31-32
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-41
• 1 細(xì)胞狀態(tài)32-33
• 2 熒光PCR法鑒定EV71-CC、CA16-CC病毒株33-34
• 3 EV71-CC、CA16-CC病毒株CCID_(50)的測(cè)定結(jié)果34
• 4 EV71-CC、CA16-CC病毒株LD_(50)的測(cè)定結(jié)果34-37
• 5 免疫方案的研究37-39
• 6 EV71-KM和CA16-KM交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)39
• 7 EV71-CA16聯(lián)合滅活疫苗對(duì)新生乳鼠的保護(hù)作用39-40
• 8 血清中和抗體效價(jià)檢測(cè)40-41
• 四、討論41-42
• 五、小結(jié)42-43
• 第三部分 過(guò)繼回輸在疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)評(píng)價(jià)中的探索性研究43-54
• 一、實(shí)驗(yàn)材料43-44
• 二、實(shí)驗(yàn)方法44-49
• 1 免疫動(dòng)物44
• 2 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞的分離44-45
• 3 CA16滅活疫苗免疫后小鼠免疫細(xì)胞亞群的流式檢測(cè)45
• 4 小鼠CD3ε~+T淋巴細(xì)胞的磁珠分選45-46
• 5 小鼠B淋巴細(xì)胞的磁珠分選46-47
• 6 CD4~+T和CD8~+T淋巴細(xì)胞的磁珠分選47-48
• 7 效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、記憶性T淋巴細(xì)胞的流式分選48
• 8 細(xì)胞富集及細(xì)胞活性檢測(cè)48
• 9 細(xì)胞過(guò)繼性回輸48-49
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-52
• 1 細(xì)胞活性檢測(cè)49
• 2 CA16滅活疫苗免疫后小鼠免疫細(xì)胞亞群的流式分析49-50
• 3 小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞回輸結(jié)果50
• 4 小鼠CD3ε~+T淋巴細(xì)胞回輸結(jié)果50-51
• 5 小鼠B淋巴細(xì)胞回輸結(jié)果51
• 6 CD4~+和CD8~+T淋巴細(xì)胞回輸結(jié)果51
• 7 記憶性T細(xì)胞、效應(yīng)性T細(xì)胞的流式分選及回輸結(jié)果51-52
• 四、討論52-53
• 五、小結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄59-60
• 致謝60-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62-63

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