本文關(guān)鍵詞：匹羅卡品癲癇模型中大鼠海馬和內(nèi)嗅皮層區(qū)TREK-2鉀通道的表達(dá)變化及意義，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：癲癇(Epilepsy)是世界上最古老的疾病之一,希臘名醫(yī)希波克拉底早在公元前5世紀(jì)就首次記錄過癲癇的發(fā)作。它是一種由于大腦神經(jīng)元突發(fā)性、反復(fù)性、發(fā)作性異常放電,導(dǎo)致短暫的大腦神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的慢性疾病。癲癇現(xiàn)已成為僅次于腦卒中的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾患。臨床常表現(xiàn)為神經(jīng)元反復(fù)放電而引起反復(fù)的驚厥發(fā)作,且具有不可預(yù)見性。目前全球約5000萬癲癇病人,然而手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)高且難以根治,藥物治療中將近30%的癲癇患者因抗癲癇藥物無法控制其發(fā)作而發(fā)展為頑固性難治性癲癇,難治性癲癇中有70%為顳葉癲癇。癲癇不僅明顯降低了患者的生活質(zhì)量,同時(shí)給家庭和社會增加了嚴(yán)重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因而尋求積極有效的治療手段是癲癇研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。雙孔鉀離子通道(Two-pore-domain potassium channels,K2P)是最新發(fā)現(xiàn)的一類鉀離子通道亞型,哺乳動(dòng)物的K2P可分為六類,共包括16個(gè)亞型,其中包括TWIK(弱內(nèi)向整流型雙孔鉀通道)、TASK(酸敏感TWIK相關(guān)雙孔鉀通道)、TREK(TWIK相關(guān)雙孔鉀通道)等亞家族。TREK-2是K2P中最重要的一員,也是K2P中分布最廣表達(dá)最多的亞類,它與TREK-1和TRAAK由于序列結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制的相似同屬TREK一類。TREK-2具有重要的生理和神經(jīng)保護(hù)作用,已經(jīng)有研究證實(shí)TREK-2廣泛表達(dá)于神經(jīng)元并在調(diào)控神經(jīng)元興奮性方面具有重要功能。而癲癇發(fā)病的電生理本質(zhì)就是多種機(jī)制導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)興奮與抑制平衡失調(diào),產(chǎn)生神經(jīng)元過度同步化放電。但是關(guān)于TREK-2在癲癇發(fā)生過程中的時(shí)空表達(dá)變化在國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題運(yùn)用鋰鹽-匹羅卡品建立癲癇模型,以TREK-2雙孔鉀通道為研究中心,采用Western-blot、免疫熒光技術(shù)觀察在匹羅卡品癲癇模型中不同時(shí)期TREK-2于癲癇主要好發(fā)部位的表達(dá)特點(diǎn),并且通過si RNA干擾技術(shù)下調(diào)TREK-2的表達(dá),進(jìn)一步觀察其對癲癇發(fā)作的影響。通過證實(shí)TREK-2雙孔鉀通道參與了癲癇的發(fā)生、發(fā)展,力圖為抗癲癇藥物的研制提供新的靶點(diǎn)并為癲癇治療提供新的指導(dǎo)策略。實(shí)驗(yàn)一:匹羅卡品誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性顳葉癲癇大鼠模型的建立目的:觀察匹羅卡品癲癇模型中大鼠的行為學(xué)特點(diǎn)、腦電圖變化和組織形態(tài)學(xué)變化。方法:(1)選用SPF級雄性SD大鼠,體重150g~200g。適應(yīng)環(huán)境1周后,大鼠在清醒狀態(tài)下,腹腔注射氯化鋰180mg/kg,18~20h后腹腔注射東莨菪堿1mg/kg,30min后腹腔注射匹羅卡品30mg/kg,給藥后根據(jù)Racine分級觀察大鼠行為學(xué)改變。持續(xù)癇性發(fā)作(Racine 4級以上)為成功模型,1h后,給予地西泮10mg/kg腹腔注射以終止癲癇發(fā)作,降低死亡率。對照的正常組大鼠于相同時(shí)間給予同樣劑量的生理鹽水。(2)在大鼠皮層區(qū)埋藏電極,全程了解癲癇發(fā)作前后的EEG動(dòng)態(tài)變化。(3)HE染色觀察模型組大鼠癲癇后不同時(shí)期海馬組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:(1)模型組在注射匹羅卡品后動(dòng)物立即有不同程度的膽堿能反應(yīng),如唾液分泌增多、流淚、腹瀉,15~20min左右,癲癇發(fā)作,表現(xiàn)為胡須抖動(dòng),點(diǎn)頭,面部抽搐,前肢和/或尾伸直、僵硬姿勢,全身性陣攣抽搐,隨后表現(xiàn)為全身性強(qiáng)直陣攣抽搐或伴站立和跌倒。模型組大鼠中89.8%有明顯的癲癇樣發(fā)作,存活率達(dá)75%。正常組大鼠未見癲癇樣發(fā)作。(2)模型組大鼠給予匹羅卡品后EEG均觀察到陣發(fā)性癇性放電,多見高電位的叢集性棘波、尖波、棘尖波。正常組大鼠EEG均表現(xiàn)為基礎(chǔ)波,未觀察到棘波、尖波等癇性波;(3)與正常組相比,模型組大鼠癲癇后不同時(shí)期HE染色發(fā)現(xiàn)海馬各區(qū)有不同程度的神經(jīng)元缺失,CA1和CA3較CA2和DG區(qū)缺失更為明顯。結(jié)論:成功建立癲癇模型,且存活率高,便于之后實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)二:TREK-2在癲癇模型中不同時(shí)期海馬區(qū)與EC區(qū)的表達(dá)變化及其與癲癇發(fā)病的關(guān)系目的:觀察匹羅卡品癲癇模型中不同時(shí)期海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2蛋白的表達(dá)變化,初步探討TREK-2在癲癇發(fā)病過程中的作用。方法:隨機(jī)數(shù)字表將56只成功癲癇模型大鼠于發(fā)作后6h、1d、3d、1w、2w、4w、8w分別迅速斷頭處死后剝離右側(cè)海馬組織和EC區(qū)組織,各時(shí)間點(diǎn)8只,標(biāo)記后置于-80℃冰箱中備Western-blot檢測TREK-2的表達(dá),正常組8只采取同樣處理。另外各時(shí)間點(diǎn)另取3只灌注后行免疫熒光染色檢測,正常組3只采取同樣處理。結(jié)果:(1)在海馬區(qū),Western-blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與正常組相比,TREK-2在誘導(dǎo)癇性持續(xù)發(fā)作后的3d開始降低(P0.05),1w,2w,4w明顯降低(P0.01),8w時(shí)仍維持在很低水平(P0.001),免疫熒光結(jié)果顯示了同樣趨勢。(2)在EC區(qū),Western-blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與正常組相比,TREK-2在誘導(dǎo)癇性持續(xù)發(fā)作后的1d明顯降低(P0.001),到2w時(shí)基本恢復(fù)到正常水平(P0.05),之后繼續(xù)降低,8w時(shí)降到最低(P0.001)。免疫熒光結(jié)果顯示了同樣趨勢。結(jié)論:在癲癇模型中不同時(shí)期,海馬區(qū)與EC區(qū)TREK-2的表達(dá)都不同程度的降低,證實(shí)TREK-2參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程。實(shí)驗(yàn)三:下調(diào)海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2對匹羅卡品癲癇模型發(fā)作的影響目的:利用TREK-2 si RNA下調(diào)海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2表達(dá),進(jìn)一步觀察對大鼠癲癇狀態(tài)的影響。方法:(1)SPF級雄性SD大鼠在麻醉下(10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射)固定于腦立體定位儀上,按照Paxinos定位海馬位置,然后按坐標(biāo)進(jìn)針。注射位置要在相應(yīng)部位埋套管針灌注后切取腦片確定。實(shí)驗(yàn)共需SD大鼠18只,隨機(jī)分為正常對照組(sham),溶劑組(no si RNA),亂序RNA組(scr RNA),TREK-2 si RNA-A組(5n M),TREK-2 si RNA-B組(5n M),TREK-2 si RNA-B組(10n M),每組3只。以速度0.5μl/min,劑量2μl進(jìn)行海馬區(qū)微量注射。Sham組只打開皮膚鉆孔但不注射任何藥品。注射72h后取材,應(yīng)用Western-blot檢測相應(yīng)海馬組織中TREK-2的表達(dá)變化。(si RNA A序列:5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’,si RNA B序列:5’-TAG GAG GGC GGA AAT ACC AAA-3’)(2)選取最佳干擾效能的TREK-2 si RNA B序列進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),將SD大鼠分為癲癇組和干擾癲癇組,采用上述同樣方法進(jìn)行海馬區(qū)定位注射2μl的溶劑和si RNA B,72h后建立癲癇模型,并對其行為學(xué)進(jìn)行觀察。其中癲癇1d組5只和干擾組癲癇后1d存活的5只進(jìn)行海馬區(qū)Western-blot取材。EC區(qū)的實(shí)驗(yàn)過程同海馬區(qū)。結(jié)果:(1)通過Western-blot對TREK-2 si RNA的干擾效能檢測,結(jié)果顯示正常對照組、溶劑組、scr RNA組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,對TREK-2蛋白表達(dá)幾乎沒有影響。與scr RNA組相比,si RNA A可以下調(diào)TREK-2蛋白表達(dá)將近30%(P0.05),si RNA B可以下調(diào)TREK-2蛋白表達(dá)將近50%以上(P0.001),且不同濃度(si RNA B 5 n M vs si RNA B 10 n M)間無明顯差異。因而選擇si RNA B序列作為之后的干擾序列,濃度選用5n M。(2)si RNA干擾TREK-2蛋白表達(dá)后,建立癲癇模型,進(jìn)行行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),與癲癇組相比,干擾組癲癇發(fā)作程度明顯增加。與癲癇1d組相比,干擾癲癇1d組TREK-2表達(dá)明顯降低(P0.01),與si RNA干擾組相比,干擾癲癇1d組TREK-2表達(dá)也明顯降低(P0.01)。結(jié)論:利用TREK-2 si RNA進(jìn)一步證實(shí)TREK-2參與了癲癇的發(fā)生發(fā)展過程,降低海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2的表達(dá)加重了癲癇發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：癲癇 雙孔鉀通道 TREK-2 海馬 內(nèi)嗅皮層
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1;R-332
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-27
• 實(shí)驗(yàn)一 匹羅卡品誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性顳葉癲癇大鼠模型的建立27-38
• 1 材料27-28
• 2 方法28-31
• 3 結(jié)果31-35
• 4 討論35-38
• 實(shí)驗(yàn)二 TREK-2 在癲癇模型中不同時(shí)期海馬與EC區(qū)的表達(dá)變化及其與癲癇發(fā)病的關(guān)系38-50
• 1 材料38-39
• 2 方法39-43
• 3 結(jié)果43-48
• 4 討論48-50
• 實(shí)驗(yàn)三 下調(diào)海馬區(qū)和EC區(qū)TREK-2 對匹羅卡品癲癇模型發(fā)作的影響50-59
• 1 材料50
• 2 方法50-52
• 3 結(jié)果52-57
• 4 討論57-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 個(gè)人簡歷和研究成果66-67
• 致謝67-68

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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  本文關(guān)鍵詞：匹羅卡品癲癇模型中大鼠海馬和內(nèi)嗅皮層區(qū)TREK-2鉀通道的表達(dá)變化及意義，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：391930